Protein oprensning
valg af udgangsmateriale er nøglen til udformningen af en renseproces. I en plante eller et dyr fordeles et bestemt protein normalt ikke homogent i hele kroppen; forskellige organer eller væv har højere eller lavere koncentrationer af proteinet. Anvendelse af kun væv eller organer med den højeste koncentration nedsætter de mængder, der er nødvendige for at producere en given mængde oprenset protein. Hvis proteinet er til stede i lav overflod, eller hvis det har en høj værdi, kan forskere bruge rekombinant DNA-teknologi til at udvikle celler, der producerer store mængder af det ønskede protein (Dette er kendt som et ekspressionssystem). Rekombinant ekspression gør det muligt at mærke proteinet, f.eks. ved hjælp af et his-tag eller Strep-tag for at lette oprensningen, hvilket reducerer antallet af krævede oprensningstrin.
en analytisk oprensning anvender generelt tre egenskaber til at adskille proteiner. For det første kan proteiner renses i henhold til deres isoelektriske punkter ved at køre dem gennem en pH-graderet gel eller en ionbytningskolonne. For det andet kan proteiner adskilles i henhold til deres størrelse eller molekylvægt via størrelse eksklusionskromatografi eller ved SDS-side (natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese) analyse. Proteiner renses ofte ved hjælp af 2D-side og analyseres derefter ved fingeraftryk af peptidmasse for at fastslå proteinidentiteten. Dette er meget nyttigt til videnskabelige formål, og detektionsgrænserne for protein er i dag meget lave, og nanogrammængder af protein er tilstrækkelige til deres analyse. For det tredje kan proteiner adskilles ved polaritet/hydrofobicitet via højtydende væskekromatografi eller omvendt fasekromatografi.
normalt indeholder en proteinrensningsprotokol et eller flere kromatografiske trin. Den grundlæggende procedure i kromatografi er at strømme opløsningen indeholdende proteinet gennem en søjle pakket med forskellige materialer. Forskellige proteiner interagerer forskelligt med søjlematerialet og kan således adskilles med den tid, der kræves for at passere søjlen, eller de betingelser, der kræves for at eluere proteinet fra søjlen. Normalt påvises proteiner, når de kommer ud af søjlen ved deres absorbans ved 280 nm. Der findes mange forskellige kromatografiske metoder:
størrelse ekskludering kromatografidit
kromatografi kan bruges til at adskille protein i opløsning eller denatureringsbetingelser ved hjælp af porøse geler. Denne teknik er kendt som størrelse udelukkelse kromatografi. Princippet er, at mindre molekyler skal krydse et større volumen i en porøs matrice. Følgelig vil proteiner med et bestemt interval i størrelse kræve et variabelt volumen eluent (opløsningsmiddel), inden de opsamles i den anden ende af gelkolonnen.
i forbindelse med proteinrensning samles eluenten normalt i forskellige reagensglas. Alle reagensglas, der ikke indeholder noget målbart spor af proteinet, der skal renses, kasseres. Den resterende opløsning er således lavet af proteinet til rensning og andre proteiner af samme størrelse.
Separation baseret på ladning eller hydrofobicitetredit
hydrofob interaktionskromatografiredit
HIC-medier er amfifile, med både hydrofobe og hydrofile regioner, hvilket muliggør adskillelse af proteiner baseret på deres overfladehydrofobicitet. Målproteiner og deres produktaggregatarter har tendens til at have forskellige hydrofobe egenskaber, og fjernelse af dem via HIC renser yderligere proteinet af interesse. Derudover anvender det anvendte miljø typisk mindre barske denatureringsbetingelser end andre kromatografiteknikker, hvilket hjælper med at bevare proteinet af interesse i dets oprindelige og funktionelle tilstand. I rent vand ville interaktionerne mellem harpiksen og de hydrofobe regioner af protein være meget svage, men denne interaktion forbedres ved at anvende en proteinprøve på HIC-harpiks i buffer med høj ionstyrke. Bufferens Ioniske styrke reduceres derefter til eluere proteiner i rækkefølge efter faldende hydrofobicitet.
ionbytningskromatografiredit
ionbytningskromatografi adskiller forbindelser i henhold til arten og graden af deres ioniske ladning. Den kolonne, der skal bruges, vælges efter dens type og ladningsstyrke. Anionbytterharpikser har en positiv ladning og bruges til at tilbageholde og adskille negativt ladede forbindelser (anioner), mens kationbytterharpikser har en negativ ladning og bruges til at adskille positivt ladede molekyler (kationer).
før separationen begynder, pumpes en buffer gennem søjlen for at ækvilibrere de modstående ladede ioner. Efter injektion af prøven udveksles opløste molekyler med bufferionerne, da hver konkurrerer om bindingsstederne på harpiksen. Længden af tilbageholdelsen for hvert opløst stof afhænger af styrken af dets ladning. De svageste ladede forbindelser vil eluere først, efterfulgt af dem med successivt stærkere ladninger. På grund af adskillelsesmekanismens art spiller pH, buffertype, bufferkoncentration og temperatur alle vigtige roller i styringen af adskillelsen.
ionbytningskromatografi er et meget kraftfuldt værktøj til brug i proteinrensning og bruges ofte i både analytiske og præparative separationer.
fri strøm-elektroforeseredit
fri strømningselektroforese (FFE) er en bærerfri elektroforeseteknik, der tillader præparativ proteinseparation i en laminær bufferstrøm ved hjælp af et ortogonalt elektrisk felt. Ved at gøre brug af en pH-gradient, der for eksempel kan induceres af ampholytter, tillader denne teknik at adskille proteinisoformer op til en opløsning på < 0,02 delta-pI.
Affinitetskromatografirediger
affinitetskromatografi er en separationsteknik baseret på molekylær konformation, som ofte anvender applikationsspecifikke harpikser. Disse harpikser har ligander fastgjort til deres overflader, som er specifikke for forbindelserne, der skal adskilles. Oftest fungerer disse ligander på en måde, der ligner den for antistof-antigen-interaktioner. Denne” lås og nøgle ” passer mellem liganden og dens målforbindelse gør den meget specifik og genererer ofte en enkelt top, mens alt andet i prøven ikke er opnået.
mange membranproteiner er glycoproteiner og kan renses ved lectinaffinitetskromatografi. Vaskemiddelopløselige proteiner kan få lov til at binde til en kromatografiharpiks, der er blevet modificeret til at have et kovalent bundet lectin. Proteiner, der ikke binder til lektinet, vaskes væk, og derefter kan specifikt bundne glycoproteiner elueres ved at tilsætte en høj koncentration af et sukker, der konkurrerer med de bundne glycoproteiner på lektinbindingsstedet. Nogle lectiner har høj affinitetsbinding til oligosaccharider af glycoproteiner, der er svære at konkurrere med sukkerarter, og bundne glycoproteiner skal frigives ved denaturering af lectinet.
Immunoaffinity kromatografirediger
Immunoaffinitetskromatografi bruger den specifikke binding af et antistof-antigen til selektivt at rense målproteinet. Proceduren involverer immobilisering af et protein til et fast substrat (f.eks. en porøs perle eller en membran), som derefter selektivt binder målet, mens alt andet strømmer igennem. Målproteinet kan elueres ved at ændre pH eller saltholdigheden. Den immobiliserede ligand kan være et antistof (såsom Immunoglobulin G), eller det kan være et protein (såsom Protein a). Da denne metode ikke involverer teknik i et tag, kan den bruges til proteiner fra naturlige kilder.
oprensning af et mærket proteinEdit
en anden måde at mærke proteiner på er at konstruere et antigenpeptidmærke på proteinet og derefter rense proteinet på en søjle eller ved at inkubere med en løs harpiks, der er belagt med et immobiliseret antistof. Denne særlige procedure er kendt som immunudfældning. Immunopræcipitation er ret i stand til at generere en ekstremt specifik interaktion, som normalt resulterer i binding kun det ønskede protein. De rensede mærkede proteiner kan derefter let adskilles fra de andre proteiner i opløsning og senere elueres tilbage til ren opløsning.
når tags ikke længere er nødvendige, kan de spaltes af en protease. Dette involverer ofte konstruktion af et protease-spaltningssted mellem mærket og proteinet.
HPLCEdit
højtydende væskekromatografi eller højtryksvæskekromatografi er en form for kromatografi, der anvender højt tryk for at drive de opløste stoffer hurtigere gennem søjlen. Dette betyder, at diffusionen er begrænset, og opløsningen forbedres. Den mest almindelige form er” omvendt fase ” HPLC, hvor søjlematerialet er hydrofobt. Proteinerne elueres af en gradient af stigende mængder af et organisk opløsningsmiddel, såsom acetonitril. Proteinerne eluerer i henhold til deres hydrofobicitet. Efter oprensning med HPLC er proteinet i en opløsning, der kun indeholder flygtige forbindelser og let kan fryses. HPLC-oprensning resulterer ofte i denaturering af de oprensede proteiner og er således ikke anvendelig på proteiner, der ikke spontant genfoldes.