Proteinase K
aktiveret af calcium fordøjer proteinerne fortrinsvis efter hydrofobe aminosyrer (alifatiske, aromatiske og andre hydrofobe aminosyrer). Selvom calciumioner ikke påvirker aktiviteten, bidrager de til dens stabilitet.Proteiner fordøjes fuldstændigt, hvis inkubationstiden er lang, og proteasekoncentrationen er høj nok. Når calciumionerne fjernes, reduceres stabiliteten, men den proteolytiske aktivitet forbliver. Proteinase K har to bindingssteder for Ca2+, som er placeret tæt på det aktive center, men er ikke direkte involveret i den katalytiske mekanisme. Den resterende aktivitet er tilstrækkelig til at fordøje proteiner, som normalt forurener nukleinsyrepræparater. Derfor udføres fordøjelsen med Proteinase K til oprensning af nukleinsyrer sædvanligvis i nærvær af EDTA (inhibering af metalionafhængige stoffer, såsom nukleaser).
Proteinase K er også stabil over et bredt pH-område (4-12) med et pH-optimum på pH 8,0.En forhøjelse af reaktionstemperaturen fra 37 liter C til 50-60 liter C kan forøge aktiviteten flere gange, ligesom tilsætningen af 0,5–1% natriumdodecylsulfat (SDS) eller Guanidiniumchlorid (3 M), Guanidiniumthiocyanat (1 M) og urinstof (4 M). De ovennævnte betingelser forbedrer proteinase K-aktiviteten ved at gøre dens substratspaltningssteder mere tilgængelige. Temperaturer over 65 liter C, trichloreddikesyre (TCA) eller serinproteasehæmmere aebsf, PMSF eller DFP hæmmer aktiviteten. Proteinase K vil ikke blive hæmmet af Guanidiniumchlorid, guanidiniumthiocyanat, urinstof, Sarkosyl, Triton 100, mellem 20, SDS, citrat, iodeddikesyre, EDTA eller af andre serinproteasehæmmere som Na-Tosyl-Lys Chlormethylketon (TLCK) og Na-Tosyl-Phe Chlormethylketon (TPCK).
Protease K aktivitet i almindeligt anvendte buffere
| Buffer (pH = 8,0, 50 liter C, 1,25 liter/mL protease K, 15 min inkubation) | Proteinase k-aktivitet (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris * Cl | 100 |
| 30 mm Tris * Cl; 30 mM EDTA; 5% mellem 20; 0,5% Triton 100; 800 mM GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris * Cl; 36 mM EDTA; 5% mellem 20; 0,36% Triton * 100; 735 mM GuHCl | 301 |
| 10 mm Tris * Cl; 25 mm EDTA; 100 mM NaCl; 0,5% SDS | 128 |
| 10 mm Tris * Cl; 100 mm EDTA; 20 mM NaCl; 1% Sarkosyl | 74 |
| 10 mM Tris * Cl; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,45% mellem 20; 0,5% Triton-100 | 106 |
| 10 mM Tris * Cl; 100 mm EDTA; 0.5% SDS | 120 |
| 30 mm Tris * Cl; 10 mM EDTA; 1% SDS | 203 |