Bile-Esculin Teste Presuntivo para Identificação de Enterococos e Estreptococos: Efeitos da Bile, Concentração, Técnica de Inoculação, e Tempo de Incubação

o reconhecimento e diferenciação dos cocci Gram-positivos catalase-negativos, Alfa-hemolíticos e não-hemolíticos em pares e cadeias como enterococos; estreptococos do Grupo D (mainlyStreptococcus bovis); e estreptococos do Grupo D viridans não-grupo D são clinicamente importantes (10). O teste bile-esculin é amplamente utilizado para diferenciar enterococci e streptococci do Grupo D, que são tolerantes à bílis e podem hidrolizar esculina para esculetina, a partir do grupo não-grupo D viridans streptococci, que crescem mal na bílis. Descrita pela primeira vez em 1926, por Meyer e Schonfeld (8), a bile-esculin teste foi mostrado por Facklam e Moody (2, 3, 5) ter uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 97% para a identificação de enterococos e grupo D estreptococos. Estes resultados foram obtidos com agar inclinações contendo 4% oxgall (sais biliares), inoculados com 1 ou 2 gotas de uma recepção disponível 24 h Todd-Hewitt cultura do organismo (“o dia seguinte” de inoculação), e incubadas por 48 h. Na rotina de diagnóstico de bacteriologia, tal protocolo é impraticável, pois não necessita de 3 dias a partir do momento colônias são detectados no primário placas. A maioria dos manuais e manuais de procedimentos recomendam a inoculação de Agar diretamente de algumas colônias (inoculação”no mesmo dia”) em vez de uma subcultura de 24-h em caldo, mas os dados que suportam esta técnica alternativa não-padronizada estão faltando.

portanto, avaliamos a sensibilidade e especificidade do teste bile-esculin com dois métodos diferentes de inoculação do mesmo dia (padronizado e não normalizado) e dois tempos de incubação diferentes (24 e 48 h). Nós também comparamos os slants esculin contendo 2 e 4% oxgall em formulações atualmente disponíveis a partir de duas principais fontes comerciais nos Estados Unidos.

Catalase-negativos, cocos gram-positivos, em pares e em cadeias de formação de alfa-hemolíticas ou nonhemolytic colônias em 5% sheep blood agar que foram positivas para PYR (Trunculus, Dartford, no Reino Unido) e cresceu em tríptico caldo de soja contendo 6,5% de NaCl (Becton Dickinson Microbiology Systems , Cockeysville, Md.) foram identificados como enterococos; eles foram especializados com o sistema API Rapid Strep (bioMérieux Vitek, Hazelwood, Mo.). Catalase-negativo, cocci gram-positivo em pares e cadeias formando colónias Alfa-hemolíticas ou não-hemolíticas que eram negativas para a PIR, não cresceu em 6,5% NaCl, foi positivo para o antigénio do Grupo D por aglutinação em látex (Murex), e teve um padrão sugestivo (≥90% de probabilidade) bioquímico pelo sistema API Rapid Strep foram identificados como S. bovis. Cocci gram-positivo Catalase-negativo em pares e cadeias formando colónias Alfa-hemolíticas ou não-hemolíticas que eram negativas para o antigénio PYR e o Grupo D (E eram insolúveis na bílis se alfa-hemolíticos) eram chamados streptococos do grupo viridans.

Um total de 110 enterococcal cepas (34 Enterococcus faecalis, de 15 de Enterococcus faecium, e 61 nonhemolytic e nonspeciated cepas), 30 de S. bovis cepas (2 alfa-hemolíticas e 28 não-hemolíticas cepas), e 110 não-grupo D grupo viridans cepas de estreptococos (83 alfa-hemolíticas e 27 das estirpes não hemolíticas) foram testados. As estirpes foram isoladas consecutivamente a partir de culturas de sangue realizadas no Duke University Medical Center durante um período de 4 anos, exceto para 19 S. bovisstrains que foram obtidas a partir da Clínica Mayo.

Fresco (24 h), as bactérias foram inoculadas em três diferentes esculin agar inclinações, contendo ou não bile (BDMS), 2% oxgall (equivalente a 20% de bile) (BDMS), ou 4% oxgall (equivalente a 40% de bile) (Remel, Lenexa, Kans.). Exceto oxgall, as composições dos três meios eram as mesmas. Para cada meio, foram utilizadas as duas seguintes técnicas de inoculação: (i) inoculação direta e não padronizada em forma de S de 1 a 10 colônias e (ii) inoculação indireta e padronizada de 10 µl (ciclo calibrado) de uma suspensão padrão de 0,5 McFarland de bactérias em água desionizada estéril. As lamas foram incubadas a 35 ° C no ar ambiente (2) com tampas soltas durante 48 horas. As leituras foram feitas a 24 e 48 h. uma reação foi considerada positiva quando metade ou mais do meio foi escurecido (4).

com uma excepção, todas as 110 estirpes enterocócicas apresentaram reacções positivas claras após 24 e 48 h de incubação (sensibilidade de 99%). O inóculo padronizado (aproximadamente 106 UFC) era tão sensível quanto o inóculo mais pesado e não padronizado. Facklam e Moody, a utilização de um inóculo de 107 a 108 UFC em agar inclinações, informou uma sensibilidade de 100% em 48 h, mas encontra-se a 2 de 76 (5) e 6 de 157 (3) enterococcal variedades de ser bile-esculin negativo (98% de sensibilidade), após 24 h de incubação. Swan (13), utilizando um inóculo não normalizado descrito como pesado, bem como placas de ágar em que qualquer escurecimento foi considerado um resultado positivo, obteve uma sensibilidade de 100% a 24 h com 121 estirpes enterocócicas. No entanto, com base nas publicações do Facklam, a maioria dos manuais e manuais de procedimentos recomendam incubação para 48 horas antes de relatar um resultado negativo.

todas as 30 estirpes de S. bovis foram positivas a 24 e 48 h, independentemente da concentração biliar ou do método de inoculação (sensibilidade a 100%). O Facklam (3) apresentou uma sensibilidade de 94 e 100% às 24 e 48 h, respectivamente, com 37 estirpes estreptocócicas do Grupo D.

a Tabela 1 apresenta as percentagens de testes falso-positivos à bílis-esculina para 110 estirpes estreptocócicas do grupo não-grupo D de viridans. Descobrimos que a especificidade (100% menos a porcentagem de falsos positivos) foi máxima (97%), com um inóculo padronizado de listras em agar inclinações contendo 4% oxgall e leitura após 24 h. Falsos positivos foram obtidos com duas Streptococcus milleriand um Streptococcus lactis subsp. diacetilactisstrainas. A falta de padronização do inóculo, a diminuição da concentração de oxgall para 2% e o prolongamento do tempo de incubação para 48 h aumentaram o número de falsos positivos para um máximo de 24%. Em estudos anteriores com um ágar selectivo de esculina contendo azida de sódio e apenas 10% bílis, foram frequentes reacções positivas com estreptococos do grupo viridans não-grupo D (6, 11, 12). Não foram publicados anteriormente dados sobre a utilização de um meio contendo 2% de oxgall. Os nossos resultados sugerem que esta concentração é subóptima. Utilizando 4% de oxgall, o Swan (13) encontrou duas estirpes estreptocócicas do grupo viridans tolerantes à bílis de 21 isolados; nenhuma das estirpes, contudo, hidrolisou a esculina a 24 h. Facklam et al. especificidades relatadas de 99% a 24 h (3) e 81 (4) a 97% (3) a 48 h com 4% de oxgall.

Uma diferença marcante foi encontrado quando os subgrupos de alfa-hemolíticas e nonhemolytic não-grupo D grupo viridans estreptococos foram comparados para o número de falsos positivos. Para alfa-hemolíticas cepas, este número foi de 0% após 24 h e 3%, após 48 h, enquanto que para o das estirpes não hemolíticas foi de 11% após 24 h e 33% após 48 h, com 4% oxgall e um inóculo padronizado (P = 0,017 24-h valores; bicaudal, teste exato de Fisher). Tal observação não foi notificada anteriormente.

para amostras que não sejam de sangue e locais normalmente estéreis, um fluxograma baseado no teste da bílis-esculina combinado com uma tolerância de NaCl de 6,5% ou presença de PIR é suficiente para a identificação fiável dos enterococos. Os organismos bílis-esculin-positivos do sangue e os locais normalmente estéreis devem ser especializados. Especiação de enterococci é útil por razões epidemiológicas e porque E. faecium e outras espécies tendem a ser mais resistentes aos antibióticos do que E. fecalis (8, 9). Uma identificação definitiva de SF. bovis é importante, uma vez que o organismo está associado ao carcinoma colônico, que deve ser descartado nesses pacientes (7). Por outro lado, relatórios falsos-positivos de ofS. o bovis pode levar a investigações desnecessárias. A especiação de organismos bílis-esculin-positivos permitirá também a detecção de streptococos do Grupo D viridans falsos-positivos. Erros terapêuticos podem ocorrer com a identificação errada de estreptococos e enterococos (1). A especiação de rotina de organismos biliesesculin negativos não é necessária, uma vez que os enterococos e os estreptococos do Grupo D raramente dão reacções falsas-negativas.

Em conclusão, a bile-esculin teste funciona bem rapidamente separar os enterococos e os estreptococos do grupo D de não-grupo D grupo viridans estreptococos a baixo custo e com boa sensibilidade (>99%) e especificidade (97%), desde que realizada em ágar inclinações contendo 40% de bile, feito com um inóculo padronizado (10 µl de um padrão de McFarland de 0,5 bacterianas em suspensão), e leia em 24 h.

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