Cell Biology 06: the Cytosqueleton Part II: Tubulin

These are notes from lecture 6 of Harvard Extension’s Cell Biology course.Na semana passada cobrimos microfilamentos feitos de actina. Esta semana: microtúbulos, feitos de tubulina. Porque é que o citoesqueleto precisa de dois sistemas separados? Considere que os microfilamentos são apenas cadeias de subunidades individuais, enquanto os microtúbulos são literalmente tubos (como veremos em breve) – cilindros ocos com paredes feitas de correntes feitas de dimeros. Estas diferentes estruturas significam capacidades diferentes: os microfilamentos podem mais facilmente formar-se espontaneamente, e podem se ramificar (com a ajuda de Arp2/3 e outros complexos discutidos da última vez), a fim de formar diferentes formas de rede e conectar diferentes partes da célula. Os microtúbulos dependem mais fortemente da nucleação para formar, e são basicamente uma rede falada ligando o centrossoma à periferia da célula. Na prática, os microfilamentos são abundantes no córtex celular e fortemente envolvidos em movimentos contrácteis e motilidade celular, enquanto os microtúbulos estão mais envolvidos na organização de organelas e servindo como faixas para o transporte anterógrado e retrógrado.

Microtúbulos

(Imagem graças à Wikimedia Commons usuário Jeffrey81)

além de Taxas, as edições anteriores do Lodish e Cooper biologia celular livros didáticos disponíveis no NCBI também são excelentes referências.

a estrutura tubular dos microtúbulos é mais resistente do que os microfilamentos, permitindo uma grande quantidade de trabalho pesado puxando e empurrando. Embora robustas, microtúbulos são dependentes da temperatura-despolimerizam se resfriados a 4 ° C e vão repolimerizar novamente se aquecidos a 37°C, desde que o GTP esteja disponível.

o bloco básico de construção dos microtúbulos é um dímero α-tubuilina/β-tubulina (codificado por genes TUBA_ e genes TUBB_ respectivamente). Cada uma das proteínas de tubulina pesa cerca de 55kDa, por isso a cerca de 110Da / aminoácido é da ordem de 500 aminoácidos. Tanto α-Como β-tubulina ligam-se ao GTP, mas α apenas o mantém para sempre, ao passo que em β pode ser trocado ou hidrolisado para o PIB e, em seguida, trocado por novo GTP.As cadeias de dimers α/β consecutivos formam protofilamentos e 13 protofilamentos dispostos lado a lado num cilindro formam um microtúbulo. O espaço entre os protofilamentos é chamado de “costura”. O microtúbulo inteiro tem ~25 nm de diâmetro. Você pode ver a sua estrutura (feita de dimers e protofilamentos) na vida interior do segmento celular sobre microtúbulos:

dentro de cada dímero, a subunidade β é o fim ( + ), favorecido para polimerização e O α é o fim ( – ), favorecido para despolimerização. Os microtúbulos formam – se basicamente nos mesmos três passos que os microfilamentos-nucleação, elongação e estado estacionário. Mas ao contrário dos microfilamentos, eles não nucleam facilmente por conta própria, então a nucleação requer centros Organizadores de microtúbulos (MTOCs). Cada célula não-divisória tem apenas um MTOC, chamado de centrossoma. (Isto também é mostrado no vídeo acima). Localizado perto do núcleo, o centrosome é hub para uma configuração radial de microtúbulos com (-) extremidades apontadas e (+) termina apontando para a periferia celular.O centrossoma é composto por 2 cilindros chamados centrióis. Cada centriole consiste em cada 9 conjuntos de 3 lateralmente fundida microtúbulos, rodeado por um amorfo ‘material pericentriolar’ rico em coisas que promovem a nucleação – particularmente γ-tubulina anel complexos (gama tubulina é codificado pelo TUBG_ genes). γ-tubulina é considerada como uma “máquina de lavar fendida”:

o modelo é que as extremidades separadas permitem que a γ-tubulina se ligue à α-tubulina – isto é, à extremidade (-) de um microtúbulo a ser formado-fornecendo a semente de nucleação para que um microtúbulo se forme.Podem formar-se microtúbulos in vitro . A dinâmica depende principalmente de concentrações críticas. A extremidade ( – ) é menos inclinada para a polimerização do que a extremidade ( + ), por isso tem uma concentração crítica mais elevada. Se a concentração real estiver entre as concentrações críticas das duas extremidades, ocorre a treadmilling.

quando um microtúbulo subitamente começa a dissociar isto é chamado de ‘catástrofe’. Catástrofes têm uma dinâmica energética interessante. Recorde-se de antemão que a beta – tubulina, que é o fim (+) onde ocorre o alongamento, pode estar ligada ao GTP ou ao PIB. É uma parte mais estável da sua microtúbula quando está ligada ao GTP; a tubulina ligada ao PIB está apta a dissociar-se. Os microtúbulos formam-se principalmente pela adição de beta-tubulina ligada ao GTP no final ( + ), mas depois de serem adicionados, as moléculas de beta-tubulina mais tarde hidrolisam o seu GTP, deixando-os ligados ao PIB. Assim, há uma espécie de “ponta” da microtúbula que está ligada ao GTP, enquanto a beta-tubulina mais profunda no microtúbulo, adicionada há mais tempo, está ligada ao PIB. Se a fronteira da hidrólise do GTP atingir a ponta, ou se algo acontecer para cortar o microtúbulo, então a menos estável, beta-tubulina ligada ao PIB fica exposta, e os protofilamentos vão começar a descascar como “chifres de ram”. Se isto acontecer, o microtúbulo irá desmontar até atingir uma “ilha” de beta-tubulina ligada ao GTP algures mais abaixo. A catástrofe pode ser “resgatada” pela adição de novos dimers de tubulina ligados ao GTP que irão fechar as extremidades e estabilizar os protofilamentos, permitindo que o microtúbulo se forme novamente. Você pode ver neste vídeo que despolimerização de microtúbulos pode ser muito mais rápido do que polimerização:

Aqui estão alguns compostos úteis para o estudo de microtúbulos. A colchicina, um fármaco anti-gota, liga-se a dímeros alfa-beta livres, reduzindo o seu fornecimento para a formação de microtúbulos e, assim, promovendo a despolimerização. Nocodazol também interfere com a nova formação de microtúbulos, e como a formação de novos microtúbulos é importante para a mitose, nocodazol é um medicamento antineoplásico do câncer. Inversamente, o paclitaxel (taxol), outro medicamento anti-cancerígeno, actua estabilizando microtúbulos, uma vez que a degradação dos microtúbulos existentes também é importante para a mitose.

proteínas associadas a microtúbulos (mapas) têm vários papéis. Noteworthy are MAP4( in non-neuronal cells), MAP2 (in neurons) and Tau (in neurons; coded by MAPT gene). Todos eles têm em comum que atuam para estabilizar os microtúbulos, deslocando a cinética em favor do crescimento dos microtúbulos e contra a catástrofe. Cada um contém 18 aminoácidos esticados com aminoácidos positivamente carregados que se ligam à parte negativa dos microtúbulos. Eles podem agir para agrupar vários microtúbulos, com MAP2 segurando os microtúbulos a uma maior distância devido ao seu braço mais longo (em comparação com Tau).

os mapas são regulados pela fosforilação: as proteínas cinases MARK ligam covalentemente os grupos fosfato aos aminoácidos S, T ou Y nas proteínas do mapa, reduzindo a sua capacidade de se ligarem aos microtúbulos. (Cyclin dependent kinases also regulate the MAPs during mitosis). Pensa-se que estes mapas agem para determinar a estrutura física das células. Em neurônios, o MAP2 é encontrado em dendrites e Tau é principalmente no axon. Mutações no gene MAPT que codifica para Tau causam demência frontotemporal (DTF). Tau hiperfosforilado é encontrado (embora não sabemos por que) no cérebro dos pacientes de Alzheimer. Modelos de ratos de ambas as doenças mostram degeneração axonal, consistente com Tau não ser capaz de fazer o seu trabalho de estabilizar microtúbulos no axon.

outra classe de proteínas, nomeada + pontas para a sua ligação ao fim ( + ) dos microtúbulos, pode proteger contra a catástrofe. Eles parecem estender um caminho justo até ao microtúbulo. Este vídeo mostra EB – 1 sendo empurrado para fora porque as extremidades dos microtúbulos estão crescendo:

outras proteínas de ligação final promovem catástrofe ao invés de estabilidade. Cinesin-13 atua para curvar o fim dos protofilamentos, baixando o limiar da catástrofe. Stathmin (STMN1 gene; aka Op18, onde Op significa oncoprotein) vincula-se à tubulina dímeros dentro de um protofilament, promovendo a imediata catástrofe e, possivelmente, também ocorra a hidrólise de GTP, que, pela remoção de “ilhas” de GTP-vinculado beta-tubulina representaria mais de um investimento de longo prazo em favor da catástrofe. A Stathmin é regulada pela fosforilação. Katanin (depois da katana espada japonesa) literalmente corta microtúbulos.As proteínas motoras de microtúbulos são em grande parte semelhantes às proteínas motoras de microfilamentos. Eles vêm em duas famílias: kinesins, a maioria dos quais se movem anterograde ou seja, em direção ao fim ( + ); e dineins, a maioria dos quais se movem retrógrados, ou seja, em direção ao fim ( -). Eles “caminham” assim:

cinesina e dynein estão envolvidos na movimentação de organelos, endocitose e exocitose, e segregação cromossómica durante a meiose & mitose.

Cinesin-1, o melhor estudado das cinesinas, é uma cinesina ‘convencional’ na medida em que opera como um tetrâmero composto de duas unidades de cadeia pesada (genes KIF1, e.g. KIF1A) que compreendem os domínios “cabeça” que hidrolisam ATP e ligam os microtúbulos, e duas unidades de cadeia luminosa (genes KLC, por exemplo KLC1) que compreendem uma “cauda” que liga a carga, neste caso vesículas. Um domínio linker (de que proteína faz parte?) permite a dimerização de duas correntes pesadas.

aqui está um vídeo dele em ação. Note que o vídeo chama-lhe um dímero em vez de um tetramer; eu acho que isso é porque eles estão apenas considerando as cabeças e não discutindo as caudas.

algumas das outras cinesinas diferem um pouco:

• Kinesin-2, que também faz vesículas & organelle transport, é um heterotrimor com duas cadeias pesadas diferentes (embora relacionadas) e outro polipéptido que usa para regular a sua carga.
• Kinesin-5 tem cabeças em ambas as extremidades em vez de cabeça e cauda, de modo que caminha em direções opostas em dois microtúbulos diferentes, unindo-os. Isto é chamado de “movimento bipolar”.
• Cinesin-14 é a única cinesina conhecida que se move para o fim ( – ), e está envolvida na mitose.

os princípios do movimento’ andando ‘ são praticamente os mesmos para todos os cinesinos, porém, e são o que é descrito no último vídeo acima. Quando não estão ligados a um microtúbulo, as “cabeças” estão ambas ligadas ao ADP. Uma cabeça vai encontrar um microtúbulo e se ligar a ele, liberando seu ADP, permitindo que um ATP o substitua. A ligação ATP induz uma mudança de conformação que puxa sobre o linker, balançando o outro, “retardando” a cabeça para frente em posição de liderança, onde se liga ao microtúbulo. A cabeça original então hidrolisa ATP que libera fosfato (que é abreviado como Pi no vídeo) e fornece a energia para o passo energeticamente ascendente neste processo, que está se separando do microtúbulo.Miosina (a proteína motora que anda em microfilamentos) e cinesina têm estruturas muito semelhantes, mas nenhuma semelhança de sequência de aminoácidos. Assim, acredita-se que não sejam parálogos, mas sim um exemplo de evolução convergente.

as pessoas falam muito sobre as cinesinas em parte porque não entendemos as dineínas tão bem. As dineinas são proteínas enormes, feitas de 2 subunidades grandes, 2 intermédias e 2 pequenas. O seu tamanho tornou-os difíceis de isolar e caracterizar e o seu funcionamento não é bem compreendido. Sabemos que o complexo dynactin (um complexo multi-proteico; as dynactinas em si são os genes DTCN_) está envolvido como um “adaptador” que liga dynein à carga.

este vídeo resume todo o citoesqueleto e cordas em grande parte do material da semana passada e esta palestra:

PrP

como mencionado nas notas da via secreta, PrP é GPI-ancorado à membrana e sofre endocitose muito regularmente, criando vesículas endocíticas com PrP neles. Encalada 2011 descobre que Kinesin-1C e DHC1 (dynein heavy chain 1) são responsáveis pelo transporte destas vesículas PRP anterograde e retrógradas, respectivamente. Quando Encalada nocauteou, derrubou ou inibiu Kinesin-1C, anterograde e movimento retrógrado foram reduzidos, e da mesma forma quando DHC1 foi interrompido. Então parece que estes dois complexos, embora se movam em direções opostas, ativam-se uns aos outros. E curiosamente, interromper essas proteínas motoras não impediu que as vesículas de PrP se associassem aos motores – elas simplesmente não se moviam tão rápido ou tão frequentemente. O artigo tem uma série de outras conclusões de biologia celular sobre a natureza de como as vesículas ativam proteínas motoras e como a direção de transporte é determinada.