Clostridium difficile toxin B
When the catalytic threonine residue of glucosiltransferase desactivates a family of small GTPases, e.g. the Rho family; Rac, and Cdc42 inside the target cells perturbe signal transduction mechanisms, which leads to disfunctioning of actin citoseleton, cell-cell junction, and apoptosis(Fig. 5). Rho induz a atividade das fibras de estresse de actina. As proteínas da Rac controlam as actividades do ruffling de membrana e do neutrófilos da NADPH-oxidase. O Cdc42 regula a formação de filamento de F-actina em filopodia.
Citotoxicityedit
Figura 3: a toxina B altera a dinâmica da estrutura celular. Imagens de SEM: a) células de controlo e B) células tratadas com TcdB durante 18 horas. A seta Negra indica a localização da superfície celular a sangrar.
vários estudos demonstraram que a presença de TcdB nas células de mamíferos provoca alterações rápidas na morfologia celular e na sinalização celular. Dentro de um curto período de tempo, as células têm a aparência de placa com pequenas dosagens de TcdB e TcdA. Além disso, a morte das células é um grande impacto destas toxinas após as células terem sido intoxicadas. Uma investigação de Donta et al., encaminhado que o TcdB tem impactos graves em outras células de mamíferos, tais como células do ovário de hamster chinês, células epiteliais cervicais humanas, células supra-renais de ratinho, hepatócitos de rato e astrócitos de rato (Fig.3).
a actividade citotóxica baseia-se em tipos celulares que podem variar entre 4 e 200 vezes. Geralmente, quando as células são infectadas com TcdB, elas não só perdem sua integridade estrutural, mas também diminuem os filamentos de F-actina. Os auscultadores celulares por TCB não demoram mais de 2 horas (Fig. 4), mas no que diz respeito à morte celular, pode levar aproximadamente 24 horas. No que diz respeito à diarréia associada a Clostridium difficile (CDAD), os efeitos da citopaticidade são mais críticos do que a morte celular real, porque uma vez que as células perdem a integridade do filamento de actina citosqueleto, eles também perdem sua função normal.
Figura 4: efeitos da toxina B nos astrócitos do rato. Esta é uma ilustração provável de astrócitos de rato incubados com 100 ng / ml de toxina B durante 2 horas a 37 ° C.
efeitos sobre a pequena GTPasesEdit
a causa da actividade citotóxica por TcdB dentro da célula hospedeira é principalmente mediada por endocitose receptora. Os endossomas ácidos permitem que a toxina B Entre no citosol. Este fenômeno ocorre por uma região de receptor de ligação, que permite a toxina entrar nas células hospedeiras. Através da acessibilidade do citosol das células hospedeiras, o TcdB desactiva as pequenas GTPases (Fig. 5), por exemplo, os membros da família Rho Rac e Cdc42 pelo processo de glicosilação da treonina 35 em Cdc42 e Rac, e da treonina 37 em Rho. Estas Rho GTPases são encontradas ubiquitosamente no citosol de células eucarióticas que são responsáveis pela organização do citoesqueleto de actina porque as toxinas no citosol causam condensação de filamentos de actina como consequência de arredondamento celular e blebbing membrana (Fig. 3), que em última análise leva à apoptose. O TcdB causa mudanças críticas na dinâmica celular e morfologia. A figura 3 mostra o efeito provável da toxina B na superfície de uma célula; blebbing de membrana (setas Negras). Além disso, o TcdB inactiva Rho GTPases. Como consequência, as junções célula-célula são interrompidas, o que aumenta a permeabilidade epitelial da toxina B e acumulação de fluido no lúmen. Este é um dos principais agentes causadores na contratação de Clostridium diarreia associada a difficile (CDAD)(Fig. 5).
Figura 5: modificações intracelulares por TcdB. Em primeiro lugar, a toxina B liga-se à superfície da célula e é internalizada por endocitose mediada pelo receptor. Em segundo lugar, a acidificação do endossoma desencadeia a formação de um poro através do qual o GTD é translocado. Em terceiro lugar, a absorção pela UDP-glucose ajuda a ligar-se às GTPases e a libertar-se no citosol. Finalmente, os glucosilatos GTD da família GTPases na membrana celular e regulação da transcrição de controle e, finalmente, apoptose da célula.
além disso, a taxa de hidrólise da UDP-glucose pelo TcdB é aproximadamente cinco vezes superior à TcdA. Vários estudos indicaram que Rho exibe modificação pós-transferacional através de prenilação e carboximetilação, que ocorre no lado citoplásmico da membrana plasmática, portanto, a troca de GTP para o PIB. Quando o TcdB se liga ao Rho e a outras pequenas GTPases, o GTP hidrolisa o PIB, o que leva ao GTP-bound (ativo) ao GDP-bound (inativo) (Fig. 5). Além disso, esta actividade de intercâmbio é regulada por factores de guanina no citosol da célula.A regulação celular de Rho, Rac e Cdc42 tem efeitos fora da vizinhança dos filamentos de actina do citoesqueleto (Fig. 4), Estas pequenas GTPases são incorporadas no ciclo celular que regula os sinais através da proteína ativada pelo mitogênio cinase cinases (MAPKKs). Algumas partes fisiológicas das células que não estão envolvidas em filamentos de actina, podem não causar o arredondamento celular ou a morte celular imediatamente, mas na atividade da via a jusante, podem levar à deterioração dos filamentos de actina e, por último, à morte celular.
em 1993, Um estudo realizado por Shoshan et al., mostrou que as células com TcdB alteraram a atividade da fosfolipase A2. Este foi um evento independente da ruptura do citoesqueleto de actina. Shoshan et al., também mostrou que o TcdB inibiu a atividade sinalizadora do receptor desativando as proteínas Rho via fosfolipase D.
formationEdit
TcdB acede ao interior da célula através da endocitose mediada pela clatrina, quando a toxina B faz parte do citosol, a glucosiltransferase passa através da membrana endossómica, que diminui o pH, induz a translocação e, finalmente, conduz a alterações morfológicas dos resíduos da região de translocação (958-1130). As regiões hidrofóbicas estão incorporadas na membrana hospedeira para formar poros que permitem a passagem de domínios de glucosiltransferase. Quando as células são infectadas com TcdB em um ambiente ácido, ele atenua as toxinas e causa rearranjos de forma(Fig. 6). Como consequência do pH ácido, o Tcbd apresenta diferenças claras na fluorescência original do triptofano, susceptibilidade das proteases e superfícies hidrofóbicas. Outro grupo mostrou que a acidificação leva a alterações conformacionais da toxina e, mais importante, ajuda a formar poros. Uma região de translocação putativa (Fig. 2) faz-se aproximadamente 801-1400 aminoácidos, dos quais os resíduos 958-1130 são hidrofóbicos e são responsáveis pela formação de poros transmembranares. A maioria dos estudos utilizou a estirpe TcdB 630 para mostrar a actividade de formação de poros de toxinas C. difficile.
induzido por edit
para ver se os efeitos da clivagem proteolítica do TCB ocorre na superfície celular ou nos endossomas ácidos, os estudos utilizaram a Bafilomicina A1, que é conhecida por bloquear as V-Tipo H+-ATPases dos endossomas. Isto reduz a acidez nos endossomas. A via fisiológica de Absorção Do TCB previne a actividade citopática por TCB. Quando as células se encontravam em condições ácidas (pH 4.0) durante 5 minutos após a ligação do TcdB à superfície celular a 37 graus Celsius, observaram-se rearranjos de forma e arredondamentos. No entanto, quando as células arredondadas foram incubadas durante mais uma hora em pH neutro (7.0) com parâmetros semelhantes, não se observou arredondamento das células. Ambos os estudos mostraram que a toxina B tem uma propriedade da clivagem proteolítica, que é fundamental para o acesso ao citosol. O pH ácido do endossoma conduz a alterações topológicas do TcdB (Figura 6).
Figura 6: domínio de organização do TcdB.Mostrando a diferença entre pH neutro e ácido (4).
GeneticsEdit
o gene que codifica a proteína TcdB, tcdB, está localizado na região cromossômica de 19,6 kb. Isto é conhecido como o local de patogenicidade ou PaLoc (Figura 2). O quadro de leitura aberta (ORF) para tcdB é de 7.098 nucleótidos de comprimento. É importante mencionar que-além dos principais genes da toxina na região de PaLoc – existem outros três genes acessórios que codificam na região de PaLoc: tcdR( L), tcdC (R) e tcdE no meio. Estes genes ajudam a regular a expressão TcdA e Tcbd. Eles também ajudam a segregar ou libertar as toxinas da célula. O gene de codificação tcdE, localizado entre tcdB e tcdA, é análogo às proteínas holinas, portanto, sugere-se que o tcdE funciona como um gene facilitador que aumenta a libertação ou secreção de TcdA e TcdB, consequentemente aumentando a permeabilidade da membrana da célula hospedeira.
Figura 2: Locus de patogenicidade arquetípica (PaLoc), codificando as grandes toxinas clostridianas (LCTs) envolvidas em C. infecções difíceis CDI.
detectionEdit de toxina
existem diferentes tamanhos de plasmídeos de C. difficile. As massas moleculares detectadas variam entre 2. 7×106 e 100×106, mas as dimensões dos plasmídeos não mostram qualquer correlação com a toxicidade. A fim de detectar o nível de toxina B em C. difficile, os médicos utilizam extensivamente ensaios de cultura celular derivados de amostras de fezes de doentes com CMP. O ensaio de cultura celular é considerado um “padrão-ouro” para a detecção de toxicidade em C. difficile, porque uma pequena quantidade de toxina B é capaz de causar arredondamento celular (Fig. 4), Portanto, é uma grande vantagem dos laboratórios clínicos fazer correlações com a CDD causada pelo TcdB. Embora tenha sido encontrada actividade citotóxica de grandes toxinas clostridiosas (LCTs) em amostras de fezes de doentes com PCM, a actividade da toxina B teve efeitos citotóxicos mais prejudiciais em comparação com a toxina A. Portanto, a actividade da toxina A é atenuada quando não está isolada da toxina B. A detecção da toxicidade de C. difficile é extremamente sensível, no entanto, utilizando o ensaio de cultura celular permite aos laboratórios clínicos superar o desafio; a utilização de doses tão pequenas como 1 pg/mL de toxina B é suficiente para provocar arredondamento celular. Esta é a principal vantagem na utilização do ensaio de tecidos de cultura para detectar toxicidade em doentes com PCM. Embora os laboratórios clínicos tenham tentado utilizar um ensaio de imunoabsorção enzimática em placa de microtiterador (ELISA) e outras técnicas para detectar a actividade citotóxica da toxina B nas fezes dos doentes com CMP, os resultados não são tão precisos como aqueles em que foram utilizados ensaios de cultura celular.
Factor de produção
por adição de antimicrobianos, por ex. a clindamicina, no meio de crescimento da Cultura, Estudos demonstraram que a actividade citotóxica nas culturas de C. difficile Aumenta 4 a 8 vezes. Além disso, conhecendo o papel dos antibióticos nas causas da CMP, muitos estudos anteriores focaram os efeitos da produção de toxinas antimicrobianas. Como resultado, estudos foram capazes de concluir que a natureza subinibitória dos níveis de vancomicina e penicilina estavam aumentando a produção de toxina em culturas de C. difficile. As quantidades de produção de toxinas estavam correlacionadas com o uso de meio de crescimento para os organismos. Outro estudo ilustrou que os elevados níveis de produção de toxinas do TcdB foram observados em médiuns complexos como o caldo de infusão cerebral e cardíaca. Altos níveis de toxinas foram produzidos com isolamento de altamente virulento. Inversamente, baixos níveis de toxinas foram produzidos com isolamento de fraca virulência. Assim, mostra que as produções de toxinas foram co-reguladas. Embora o mecanismo subjacente ao envolvimento do ambiente na modulação dos sinais que expressam as toxinas não seja compreendido, estudos in vitro demonstraram que a expressão da toxina é reforçada pela repressão e stress catabolita, por exemplo, antibióticos. Outro estudo mostrou que limitar a biotina em meio bem caracterizado aumenta a produção de TcdB em 64 vezes e TcdA em 35 vezes. Isto foi feito com C. difficile e doses de biotina tão pequenas como 0, 05 nM. Vários outros estudos iniciais têm argumentado contra a teoria de que a produção de toxina tem qualquer coisa a ver com estresse ou repressão catabolita de toxina TcdA ou TCB. Além disso, muitos estudos dizem que a principal razão para as diferenças entre outros estudos é devido à produção de toxina não ocorrendo com todos os isolados de C. difficile.