Comparison of Diazinon Toxicity to Temperate and Tropical Freshwater Daphnia Species
Abstract
The presence of pesticides in water bodies presents unique challenges to the ecosystem and all the life forms. Os métodos biológicos têm sido amplamente utilizados para examinar os efeitos tóxicos de vários tóxicos, incluindo pesticidas. O presente estudo visa determinar os efeitos adversos do diazinão, um insecticida organofosfato não Sistémico, em duas espécies cladoceranas, incluindo a Daphnia magna temperada (D. magna) e a Daphnia lumholtzi tropical (D. lumholtzi). Os valores de 48 H LC50 demonstraram uma maior toxicidade do diazinão para D. lumholtzi numa concentração de 3, 41 µg·L−1 em comparação com D. magna numa concentração de 4, 63 µg·L−1. Após 14 dias de exposição ao diazinão, a capacidade de sobrevivência, bem como o potencial de reprodução das duas espécies de cladoceranos, diminuíram claramente e a sua taxa de aumento populacional (IPR) diminuiu em concentrações >0,1 µg·L−1. O presente estudo indicou que o cladocerano tropical (D. lumholtzi) era mais sensível do que o temperado D. magna. Por conseguinte, pode ser utilizado como indicador de avaliação da toxicidade em ambientes tropicais. A presença de diazinão nas massas de água pode estar associada a um risco significativo para os organismos aquáticos.
1. Introdução
nas últimas décadas, a maioria dos países desenvolvidos estão mudando para uma agricultura livre de químicos, também conhecida como agricultura/agricultura “orgânica”, ou em outras palavras, diminuindo o uso de pesticidas . Isto resultou em melhorias substanciais nas práticas agronómicas guiadas por legislação rigorosa e na qualidade das massas de água naturais, ou seja, menos riscos para as vidas aquáticas . A maior parte dos países em desenvolvimento das regiões tropicais está a aumentar a sua utilização de pesticidas e fertilizantes à medida que se tornam mais ricos . Como resultado, a concentração de pesticidas em ambientes tropicais tem aumentado constantemente, causando um declínio na diversidade de espécies. Embora os pesticidas tenham certos efeitos benéficos para as culturas agrícolas, a sua utilização pode causar uma vasta gama de efeitos tóxicos em diferentes organismos não-alvo .
Diazinão (o, o-dietil – o-fosforotioato) é um insecticida organofosfato não Sistémico. Era comumente usado para inserir controle em culturas agrícolas . A toxicidade do diazinão resulta da inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE), levando à acumulação de neurotransmissores e à alteração da transmissão de sinais em sinapses químicas . Nos mercados interno e internacional, existem mais de 500 produtos registados que contêm diazinão como substância activa . Devido ao seu uso generalizado, o diazinão é frequentemente encontrado em ecossistemas de água doce . Num estudo recente, Montuori et al. relatou que o diazinão é prevalente em sistemas aquáticos em toda a Europa, com a maior concentração registrada sendo de 785 ng·L−1 no Rio Ebro, Espanha. Além disso, concentrações elevadas de diazinão até 1,5 µg·L−1 foram encontradas em vias navegáveis urbanas na Califórnia . Nas últimas décadas, o diazinão tem sido amplamente utilizado em regiões tropicais . No entanto, as leis e os regulamentos relativos aos pesticidas não foram devidamente aplicados nestas regiões, apesar das suas pesadas aplicações. Os efeitos tóxicos do diazinão estão disponíveis na literatura para o cladocerano temperado D. magna. No entanto, os efeitos tóxicos do diazinão nos zooplâncton tropicais não foram bem documentados e estudados na literatura.
o Diazinão gera uma elevada toxicidade aguda para uma grande variedade de organismos aquáticos, conduzindo a uma vasta gama de efeitos bioquímicos subletais, danos a órgãos e tecidos-alvo específicos e impactos ecológicos adversos. A toxicidade do diazinão foi extensivamente estudada nos peixes e crustáceos , tendo sido relatada ser moderadamente tóxica para os estágios iniciais da vida dos peixes-Zebra . Já foram registados os valores de LC50 de 96 h, que variam entre 0,32 e 1, 53 mg·L−1 para larvas e entre 2,2 e 10, 3 mg·L−1 para adultos de vários peixes . Yen et al. relatou que o diazinão diminui a actividade da natação larvária e inibe a actividade da AChE no peixe-zebra, bem como um aumento do teor de Hsp70. Nos cladoceranos, o diazinão na concentração de 0, 18 a 0, 30 µg·L−1 causou efeitos adversos na sobrevivência de D. magna . Estas concentrações de diazinão têm sido relatadas como causadoras de uma diminuição na média total de jovens por fêmea, tamanho médio da descendência, e taxa de aumento da população (ipr) e desenvolvimento de D. magna. Apenas a concentração acima de 0, 25 µg·L−1 causou um atraso no tempo para a primeira reprodução . Os modelos toxicocinéticos e toxicodinâmicos do diazinão e do seu subproduto 2-isopropil-6-metil-4-pirimidinol em espécies de crustáceos foram investigados por Kretschmann et al. . Results suggested that the oxidative dearylation of diazinon to pirimidinol is a crucial cellular detoxification step which is catalyzed by the enzyme P450 . No entanto, a maioria dos estudos ecotoxicológicos utilizam o cladocerano temperado D. magna como modelo ecotoxicológico; a toxicidade do insecticida em espécies de zooplâncton tropical não foi examinada na mesma medida .Neste estudo foram efectuados um ensaio agudo de 48 h e um ensaio crónico de 14 dias para estudar os efeitos do diazinão em duas espécies de cladocerano. The toxicity of diazinon to early life stages of the temperate species D. magna foi testada, e a toxicidade em D. magna foi comparada com a da espécie tropical D. lumholtzi. Os resultados fornecerão informações de base para estabelecer o valor de referência para os insecticidas de organofosfatos em águas tropicais.
2. Materiais e métodos
2.1. Produtos químicos
Diazinão (o, o-dietil – o-fosforotioato) foi comprado a Sigma-Aldrich. As soluções-mãe de 1 mM foram preparadas por diluição em sulfóxido de dimetilo (DMSO) antes do experimento e mantidas a 4°C.
2.2. No presente estudo foram utilizados organismos de ensaio
duas espécies de cladoceranos: D. lumholtzi foi isolado de um lago de peixes no norte do Vietname. D. magna foi obtida da MicroBioTest Inc. (Belgica). Ambos os dafnídeos foram cultivados em frascos de 1 L cheios com meio COMBO e mantidos a uma temperatura de 25 ± 1 ° C sob um ciclo claro : escuro de 12 h : 12 h. os animais foram alimentados com alga microgreen (chlorela sp. ) e uma mistura 1 : 1 : 1 de levedura, cerrofil e digestão do chow de truta (YTC) . O meio de alimentação e cultura foi renovado a cada dois dias.
2.3. Ensaio de Toxicidade aguda
o ensaio de imobilização aguda foi realizado de acordo com o protocolo 202 da organização para a cooperação e Desenvolvimento Económico . Este ensaio foi realizado para avaliar a sensibilidade da espécie e estabelecer a gama de concentrações a utilizar nos ensaios crónicos. Resumidamente, os recém-nascidos da Daphnia (<24 h de idade) foram mantidos em bicos de 50 mL contendo 30 mL de meio combinado com diazinão numa gama de concentrações de 0, 0.5, 1, 2, 5, e 10 µg * L-1. Em cada concentração de exposição, foram expostos 15 recém-nascidos por concentração de diazinão e por controlo em branco. Todas as exposições ao ensaio foram preparadas em triplicado. Os recipientes de ensaio foram colocados a uma temperatura controlada de 25 ± 1 ° C sob um ciclo de luz : escuro de 14 h : 10 h durante 48 h de incubação. A resposta avaliada para este ensaio foi a imobilidade ou morte dos cladoceranos. O critério de aceitação do ensaio foi uma taxa de sobrevivência igual ou superior a 90% no grupo de controlo. Por último, os dados de mortalidade registados no final dos ensaios de toxicidade (48 h) foram utilizados para determinar a concentração letal média (48 HC50).
2.4. Ensaio de toxicidade crónica
com base nos resultados de toxicidade aguda e em concentrações ambientalmente relevantes de diazinão em estudos anteriores , os dafnídeos foram expostos durante 14 dias às seguintes concentrações subletais de diazinão: 0 (controlo), 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, e 1,0 µg * L-1. O teste de reprodução foi realizado de acordo com o protocolo padrão descrito na APHA com pequenas modificações. Resumidamente, os recém-nascidos com menos de 24 h de idade foram incubados individualmente em provetas de 50 mL contendo 20 mL de meio de controlo ou expostos a concentrações de diazinão. Concentrações de diazinão e alimentos (uma mistura de algas verdes chlorela sp., com uma densidade de 5 × 106 células * mL−1, e YTC) foram renovadas a cada dois dias. A sobrevivência, a reprodução (fecundidade), o tempo para a primeira reprodução, o número total de recém-nascidos por fêmea, o número de broods e o tamanho da ninhada foram registados diariamente. O comprimento do corpo dos daphnids progenitores foi medido no final do ensaio.
2.5. A análise estatística
as concentrações letais médias de 48 h (48 H LC50) foram previstas pela análise probit, Como anteriormente relatado por Stephan . A taxa de aumento da população (RPI) foi calculada de acordo com o método sugerido por Euler–Lotka : ∑e-rxlxmx = 1, em que lx = proporção de sobrevivência à idade x, mx = fecundidade específica da idade e x = Tempo em dias. Todos os cálculos foram baseados em experiências de 14 dias . As diferenças entre os grupos de tratamento e os controlos foram determinadas através de uma análise de Sentido Único da variância (ANOVA). As diferenças significativas () foram distinguidas pelo método de ensaio da Dunnet. Todos os dados são apresentados como mediana ± DP.
3. Resultados e discussão
3.1. Toxicidade aguda
não ocorreu mortalidade no controlo durante o período experimental do ensaio agudo. A concentração de diazinão ensaiada mais elevada resultou em 100% de mortalidade de ambos os dafnídeos. No entanto, o diazinão mostrou maior toxicidade para D. lumholtzi. Os valores de 48 H de CL50 de diazinão para D. magna e D. lumholtzi nas condições experimentais testadas, com um intervalo de confiança de 95%, foram de 4,63 e 3.41 µg * L-1, respectivamente.
os efeitos tóxicos dos pesticidas nos organismos aquáticos são frequentemente investigados utilizando a dagna temperada em condições laboratoriais. No entanto, ainda há pouca compreensão sobre os efeitos agudos e crônicos do diazinão nos crustáceos, especialmente para espécies que se originaram de regiões tropicais. Os valores de 48 H de CL50 do diazinão relatados neste estudo situaram-se no intervalo com os valores de 48 h de CL50 relatados para nauplius de copepod Eodiaptomus (48 h LC50 = 2, 8 µg.L-1), Mesociclops (48 h LC50 = 2.9 µg * L-1), e Termociclops (48 h LC50 = 4.1 µg * L-1). No entanto, os valores foram inferiores a 48 h LC50 valores para adultos de Eodiaptomus (48 h LC50 = 46.8 µg·L−1), Mesocyclops (48 h LC50 = 30.6 µg·L−1), e Thermocyclops (48 h LC50 = 40.2 µg·L−1) , ou superior a 48 h LC50 valores para outras cladocerans como Ceriodaphnia dubia (48 h LC50 = 0.21 µg·L−1) . Os resultados de ensaios agudos documentaram uma maior sensibilidade do neônio tropical D. lumholtzi ao diazinão quando comparado com o temperado D. magna. De uma perspectiva de aplicação prática, estes resultados mostraram claramente que o D. lumholtzi pode servir como um substituto adequado para a espécie temperada D. magna, ou seja, como uma espécie indicador de toxicidade, em condições tropicais.
3.2. Toxicidade crónica
os efeitos das concentrações de diazinão subletal na sobrevivência e reprodução de D. magna e D. lumholtzi durante 14 dias de incubação são apresentados na Tabela 1 e na Figura 1. A sobrevivência de ambos os dafnídeos diminuiu com concentrações crescentes de diazinão durante o ensaio de 14 dias. Foram observadas diminuições significativas nas respostas dos antecedentes de vida de D. magna e D. lumholtzi quando expostos ao diazinão. Ambos os dafnídeos cresceram bem na incubação de controlo (o comprimento de D. magna e D. lumholtzi aumentou até 4,1 e 2,4 mm, respectivamente, no final da experiência). Todos os indivíduos no controle sobreviveram ao longo do período experimental (14 dias) e produziram numerosos descendentes (27,4 ± 3,6 juvenis por D. magna e 18,2 ± 2,1 por D. lumholtzi).
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Nota. .
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(a)
b)
(a)
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o Diazinão causou efeitos significativos e aumentos dependentes da dose na reprodução (número de broods por fêmea) de ambos os dafnídeos (Quadro 1). Para D. magna, o diazinão na concentração até 0,1 µg * L-1 ou superior resultou numa diminuição significativa na reprodução (número de broods por fêmea), enquanto para D. lumholtzi foi registada uma redução significativa da reprodução a partir da concentração mais baixa testada (0,05 µg·L−1). A reprodução de ambos os daphnídeos foi significativamente atrasada (), passando de 6, 5 dias para o controlo para 9, 6 dias para D. magna (como a concentração de diazinão até 0,1 µg·L−1 ou superior), e de 3,5 dias no controlo para 5,4 dias para D. lumholtzi (como a concentração de diazinão até 0,05 µg·L−1 ou superior) (Quadro 1). Os resultados de ambas as espécies testadas indicaram que o número de recém−nascidos por fêmea diminuiu significativamente à concentração de diazinão de 0, 1 µg·L-1 ou superior (Quadro 1). O comprimento médio do corpo diminuiu significativamente nesses dafnídeos (como concentração de diazinão até 0,2 µg * L-1 ou superior) durante o período de ensaio de 14 dias, de 4,1 a 3,1 mm e de 2,4 a 1,9 mm em D. magna e D. lumholtzi, respectivamente.
the results of the life-response history of both D. magna and D. lumholtzi species. A exposição a concentrações subletais de diazinão em condições laboratoriais demonstrou que o diazinão reduziu significativamente o número de crias produzidas por fêmea e atrasou-se na idade da primeira ninhada. Os resultados obtidos estão de acordo com observações anteriores que mostraram uma diminuição na produção média de descendentes e supressão do crescimento em D. magna ou Ceriodábia dubia após exposição ao diazinão .Os resultados do ensaio crónico demonstraram que D. lumholtzi era uma espécie sensível ao diazinão. Sánchez et al. suggested that crustaceans are closely related to insects, more than other invertebrates. Assim, eles são mais sensíveis aos pesticidas do que outros invertebrados. Modra et al. indicou que a toxicidade do diazinão é afetada por muitos fatores, como a capacidade de biotransformação do próprio organismo, a temperatura da água, a presença de outros poluentes e outras variáveis ambientais não identificadas. Por outro lado, utilizando um modelo cinético e dinâmico tóxico para o estudo da toxicidade diazinónica, Kretschmann et al. sugeriu que a sensibilidade das espécies em estudo ao diazinão pode depender da capacidade de desintoxicação do diazinão e do diazoxão (um metabolito tóxico do diazoxão). Estes autores revelaram que, em comparação com D. magna, o gammarus pulex de crustáceo anfipod é menos sensível ao diazinão porque a desintoxicação de diazinão e diazoxão é seis vezes mais rápido o que, por sua vez, causa menos efeitos prejudiciais. Os autores também sugeriram que modelos de efeito mecanicista deveriam ser usados para explicar as causas reais, os efeitos e as pequenas diferenças entre os diferentes invertebrados aquáticos .
3.3. Os efeitos do Diazinão na taxa de aumento da população
os efeitos do diazinão no IPR são apresentados na Figura 2. Concentrações de diazinão iguais e / ou superiores a 0,1 µg·L−1 reduziram significativamente o IPR de ambos os dafnídeos durante o ensaio crónico de 14 dias (). Pode observar-se que ambos os dafnídeos expostos ao diazinão apresentaram uma tendência quase semelhante durante o ensaio crónico de 14 dias. Em ambientes naturais, o diazinão é conhecido por causar efeitos adversos em muitas espécies de zooplâncton, incluindo Daphnia, mesmo em baixas concentrações (de 5,3 a 26,3 nM) . O IPR da população de Daphnia é um indicador importante para a previsão das tendências da população. A taxa de sobrevivência, o número de crias por fêmea e a idade de fecundidade são cruciais para a previsão . Uma redução do IPR indicava stress tóxico crónico dos pesticidas em Daphnia .
os nossos resultados indicaram que ambas as espécies de ensaio eram sensíveis ao diazinão e podiam ser utilizadas para prever o risco de insecticidas. Os resultados atuais sugerem claramente que as taxas de crescimento de D. magna e D. lumholtzi nos tratamentos de controle estavam dentro da faixa relatada na literatura . Nos países tropicais, é necessário estabelecer a referência para os insecticidas de organofosfatos. Para minimizar o risco ambiental associado aos pesticidas nos ecossistemas tropicais, recomendamos vivamente estudos adicionais sobre os efeitos tóxicos a curto e longo prazo dos insecticidas de organofosfatos em diferentes grupos tropicais de organismos.
4. Conclusões
o presente estudo confirmou que o diazinão apresenta um risco significativo para os organismos aquáticos, nomeadamente as espécies de Daphnia não-alvo. O crescimento populacional de D. magna e D. lumholtzi foi adversamente afetado pelo diazinão após um período de exposição crônica. Em comparação com D. magna, D. lumholtzi mostrou uma sensibilidade ainda maior ao diazinão no teste agudo. Os resultados deste estudo são importantes para a previsão dos efeitos tóxicos e dos riscos ambientais associados aos insecticidas. São necessários outros estudos que utilizem insecticidas adicionais de organofosfatos, diferentes espécies de ensaio tropical e condições de ensaio para avaliar o possível risco ambiental associado aos pesticidas nos ecossistemas aquáticos tropicais.