Cruzamentos genéticos

uma cruz genética é o acasalamento intencional de dois indivíduos resultando na combinação de material genético na descendência. Cruzamentos podem ser realizados em muitos sistemas modelo-incluindo plantas, leveduras, moscas e ratos—e podem ser usados para dissecar processos genéticos ou criar organismos com características novas.

este vídeo irá cobrir alguns dos princípios de cruzes genéticas, examinar um método para realizar Cruzes conhecidas como análise tetrad, e discutir várias aplicações desta técnica.Primeiro, vamos introduzir os princípios básicos da herança que tornam possíveis cruzamentos genéticos.

fenótipo de um organismo, ou composição de traços, é influenciado pela sua composição genética ou genótipo. Na maioria dos organismos que se reproduzem sexualmente, a geração parental produz células de gâmetas haplóides, que têm uma cópia de cada cromossoma distinto. Estes então se fundem durante o acasalamento para produzir uma descendência diplóide com duas cópias homólogas de cada cromossomo. Se ambos os cromossomas contêm o mesmo Alelo, ou forma variante de um gene, então o organismo é “homozigótico” naquele locus genético; caso contrário, é “heterozigótico”.”

para começar o ciclo novamente, o organismo diplóide novamente gera gâmetas haplóides via meiose. Durante este processo, os dois cromossomos homólogos passam por “recombinação”, onde bits de sequências equivalentes são trocados entre o par. Este processo baralha os alelos parentais herdados por cada descendente, aumentando assim a sua diversidade genética.Uma das primeiras pessoas a realizar Cruzes genéticas sistemáticas foi o “pai da genética”, Gregor Mendel. Usando a planta pea facilmente manipulada, e examinando uma série de traços com padrões consistentes de herança, Mendel foi capaz de derivar três leis básicas de herança que formariam a base da genética.A primeira lei de Mendel é a lei da uniformidade, que afirma que a descendência heterozigota da primeira geração de dois indivíduos homozigóticos terá o fenótipo de apenas um dos progenitores. O alelo que estabelece este fenótipo é chamado de “dominante”, enquanto o alelo” oculto “é ” recessivo”.”Agora sabemos que as relações de dominância são muitas vezes menos claras, com casos como dominância incompleta, onde heterozigotos expressam um fenótipo misturado; e co-domínio, onde ambos os fenótipos são exibidos.

a lei da segregação estabelece que um alelo é atribuído aleatoriamente a cada gâmeta. Ao observar que a descendência F2 da auto-fertilização de indivíduos heterozigotos F1 exibia um 3:1 razão fenotípica, mas que dois dos indivíduos fenotipicamente dominantes são na verdade heterozigotos, Mendel deduziu que os dois alelos parentais têm que ser herdados separadamente. Hoje, sabemos que a segregação ocorre durante a meiose, quando os dois cromossomos homólogos do progenitor diplóide são divididos aleatoriamente em células-filhas haplóides, cada uma herdando um dos dois alelos.A terceira lei de Mendel é a lei da variedade independente, que afirma que os traços individuais são herdados independentemente. Sabemos agora que a independência absoluta só existe para traços controlados por genes em cromossomas separados no conjunto haplóide, que são distribuídos independentemente para as células filhas durante a meiose. Para dois genes no mesmo cromossoma, a distância entre eles é inversamente proporcional à probabilidade de serem recombinados em diferentes cromossomas homólogos, e, por extensão, a probabilidade de serem herdados juntos na mesma descendência. Portanto, analisar os quatro produtos meióticos de um organismo diplóide fornece uma maneira para os cientistas mapearem a localização dos genes.

depois de rever os princípios por trás das Cruzes genéticas, vamos dar uma olhada em um protocolo para análise tetrad. Esta técnica é tipicamente aplicada a certas algas ou fungos de células únicas, como a levedura, para dissecar os quatro produtos meióticos haplóides, ou esporos, que nestas espécies permanecem juntos como uma “tetrad” dentro de um único corpo celular.

para efectuar a análise do tetrad na levedura, as estirpes desejadas são primeiramente cultivadas em meios apropriados. As células de levedura de colónias individuais podem acasalar, por exemplo, por estriação de cada estirpe num padrão cruzado numa placa Nova. Esta placa é então replica em meio seletivo para isolar apenas o produto diplóide da Cruz.As células diplóides seleccionadas são cultivadas em meio pobre em nutrientes para induzir esporulação e formação de tetrad. Os asci, que são as estruturas que mantêm os tetrads de esporos, são digeridos em soluções contendo a enzima zimoliase. Após a digestão, ASCI individuais são manipuladas através de um microscópio de dissecação de tetrad. Eles são dispostos em locais específicos em uma placa de crescimento, e interrompidos para libertar os esporos individuais. Estes podem ser colocados em um padrão tipo grade, onde cada esporo geraria uma colônia individual que pode ser mais analisada.

agora que você sabe como a análise tetrad é realizada, vamos examinar algumas das muitas aplicações ou modificações desta técnica.

a dissecação Manual de tetrads é demorada, e os pesquisadores têm desenvolvido alternativas de alto rendimento, como a sequenciação de tetrads com código de barras. Neste método, a progênie diplóide de uma cruz de levedura foi transformada com uma biblioteca de plasmídeos, cada um dos quais contém uma sequência curta e única conhecida como um “código de barras” que atua como um identificador para cada progênie. Os plasmídeos também expressam GFP, permitindo que ASCI de levedura seja selecionada através de citometria de fluxo e classificada em placas de ágar. Os ascos foram lisados em massa nas placas, e os esporos foram autorizados a crescer em pequenas colônias. As colônias foram então distribuídas aleatoriamente para placas de 96 poços para genotipagem. O código de barras de sequência único permite aos pesquisadores agrupar as quatro colônias que surgiram de esporos de cada tetrad.

os cruzamentos genéticos também podem ser usados para gerar células de levedura com grande número de deleções genéticas. No processo do monstro verde, levedura mutante haplóide que transporta diferentes deleções de genes marcadas por GFP são acasaladas e esporuladas. Estes descendentes haplóides, alguns dos quais transportam deleções herdadas de ambos os progenitores, são ordenados por citometria de fluxo ativada por fluorescência, onde a intensidade de GFP mostrou estar correlacionada com o número de deleções presentes numa determinada estirpe de levedura. Estas células selecionadas foram então cultivadas e re-cruzadas. Repetir este ciclo gerou estirpes de levedura contendo numerosas deleções.

finalmente, cruzamentos genéticos foram adaptados para uso em muitos sistemas modelo, tais como o Plasmodium parasita intracelular causador de malária. Como o parasita só pode se reproduzir dentro de outras células, todos os passos de cruzamento devem ser realizados em ratos ou mosquitos, hospedeiro natural do parasita e Vetor, respectivamente. Aqui, os ratos foram infectados com duas estirpes únicas de Plasmodium na fase do parasita sanguíneo. Os parasitas foram então transferidos para os mosquitos através da alimentação sanguínea, e uma vez dentro eles amadureceram em gâmetas que iriam fertilizar para formar zigotos diplóides. Os esporozoitos maduros foram então colhidos do mosquito e usados para infectar ratos sem experiência prévia, onde os parasitas foram propagados para isolar a progenitura cruzada de interesse.Acabou de ver o vídeo do JoVE sobre Cruzes genéticas. Neste vídeo, introduzimos os princípios da herança, como cruzamentos genéticos em alguns organismos podem ser analisados com dissecação tetrad, e algumas aplicações atuais. Como sempre, obrigado por assistir!