estabelecimento de um ensaio de ligação competitivo que identifique as diferentes características dos epítopos neutralizantes do vírus da hepatite e

Abstract

objectivos: confirmar as diferentes características dos epítopos neutralizantes específicos do genótipo e do vírus da hepatite e (VHE). Meios: Foi estabelecido um ensaio de ligação competitivo com anticorpos monoclonais neutralizantes (mAbs) 3G1 e 5G5, conhecidos por genótipo-comuns, bem como com mAbs neutralizantes 2B1 e 4C5, específicos para o genótipo. HEV ORF2 recombinante p166W01 derivado do genótipo 1 e p166Chn derivado do genótipo 4 foram usados como antigénios revestidos, para determinar se a Embs reconhece epitopos independentes, similares ou sobrepostos. a Embs foi produzida, purificada e conjugada com peroxidase de rábano silvestre (HRP). HRP-conjugated 2B1 poderia reagir apenas com p166W01 mas não p166Chn, conjugado a HRP 4C5 poderia reagir apenas com p166Chn mas não p166W01, enquanto HRP-conjugated 3G1 e 5G5 pode reagir tanto com p166W01 e p166Chn. Assim, ensaios de ligação competitivos foram realizados sucessivamente utilizando o antigénio p166W01 e o antigénio p166Chn. Resultados e conclusão: os resultados dos ensaios de ligação competitivos revelaram que a ligação do 2B1 conjugado com HRP ao p166W01 não podia ser inibida pelo 5G5 ou pelo 3G1. Do mesmo modo, a ligação do 4C5 conjugado com HRP a p166Chn não pôde ser inibida por 5G5 ou 3G1. No entanto, os mAbs 5G5 e 3G1 bloquearam a ligação entre si para p166W01 e p166Chn, sugerindo que os mAbs neutralizantes comuns e específicos do genótipo reconhecem epítopos independentes.

© 2018 S. Karger AG, Basel

introdução

vírus da hepatite e (HEV) é um vírus RNA não desenvolvido e positivo que é transmitido principalmente através da via oral e causa hepatite E. A infecção por VHE pode levar a prognósticos prejudiciais, por exemplo, falência da vida, hepatite aguda grave, infecção crónica no órgão transplantado e em doentes imunossuprimidos, e elevada mortalidade em mulheres grávidas . Para além da infecção confirmada em seres humanos, as VHE também infectam animais e podem ser transmitidas de animais para seres humanos; a incidência da infecção por hepatite e nos países desenvolvidos também aumentou significativamente . Estas descobertas indicam que a HEV representa uma ameaça para a saúde pública em todo o mundo .

embora um serótipo tenha sido reconhecido, isolados de VHE, derivados de diferentes áreas em todo o mundo, podem ser classificados em 4 genotipos principais . Os vhe dos genotipos 1 e 2 diferem dos genotipos 3 e 4 nas suas características epidemiológicas, antigénicas e imunogénicas .

até à data, a investigação sobre a caracterização antigénica do epitópio, baseada principalmente na proteína estrutural HEV para um sistema de cultura in vitro, não está disponível . pORF2 é a principal proteína estrutural HEV codificada por ORF2, que é 1 de 3 estruturas de leitura aberta sobrepostas (ORFs) do genoma viral . Regiões imunogênicas predominantes de pORF2 foram localizadas na região C-terminal 2/3, que foram os principais alvos do desenvolvimento de vacinas .

Nosso estudo anterior revelou a existência de um imunogenicidade diferença entre a vacina contra a hepatite E p179 (439-617 aminoácidos da ORF2 proteína), derivados de genótipo 4 e p239 (Hecolin), derivados de genótipo 1, a diferença pode ser atribuída à presença de HEV genótipo-epítopo específico(s) . Anticorpos monoclonais (mAbs) produzido em camundongos imunizados, respectivamente, com p166Sar (452-617 aminoácidos da ORF2 proteína), derivados de genótipo 1 e p166Chn derivados de genótipo 4 foram utilizados para confirmar a presença da ge notype-epítopo específico(s). Além dos 2 genotipos-mAbs neutralizantes comuns, 3g1 e 5G5, 2 genotipos-específicos de mAbs neutralizantes, 2B1 e 4C5, também foram obtidos. 2B1 contra o p166Sar pode ligar-se especificamente aos genotipos 1 e 2 proteínas recombinantes e apenas neutralizados genotipos 1 e 2 estirpes in vitro; 4C5 contra p166Chn immunoreacted especificamente contra genótipos 3 e 4 de proteínas recombinantes e neutralizado apenas o genótipo 3 e 4 cepas, enquanto 3G1 contra p166Sar e 5G5 contra p166Chn poderia ligar para genótipos 1-4 proteínas recombinantes e neutralizado 4 genótipo cepas . Para um estudo mais aprofundado das diferentes características dos epítopos de HEV neutralizantes comuns e específicos do genótipo, foi desenvolvido um ensaio de ligação competitiva utilizando mAbs 2B1, 3G1, 4C5 e 5G5, para confirmar se os epítopos reconhecidos pela mAbs são independentes, similares ou sobrepostos.

Materiais e Métodos

Proteínas Recombinantes

Recombinante p166 foi truncado, proteína de pORF2, as sequências nucleotídicas foram derivadas do seguinte HEV tensões: W01 (genótipo 1, JX857689) e China-9829 (genótipo 4, AY789225). Os plasmídeos recombinantes foram construídos e expressos em Escherichia coli . As 2 proteínas P166 foram designadas como p166W01 e p166Chn, respectivamente.A produção de mAb

mAb

um total de 4 mAbs neutralizantes, 2B1, 3G1, 4C5 e 5G5 descritos anteriormente, foram utilizados para desenvolver um teste de imunoabsorção enzimática competitivo (ELISA). 2B1 e 3G1 foram levantados contra p166Sar; 4C5 e 5G5 foram levantados contra p166Chn . Os mAbs foram produzidos através da injecção de 106 células de hibridoma na cavidade peritoneal de um rato BALB/c; o fluido ascite contendo mAbs foi colhido após 7-10 dias, filtrado, centrifugado e armazenado a -80°C.

purificação da nabs

o fluido ascite dos ABS foi purificado usando cromatografia de afinidade por coluna de proteína G-sefarose (Sigma, Alemanha). Frações contendo anticorpos foram coletadas usando o tampão de eluição ácida (0,1 m glicina-HCl, pH 2.8) a partir da proteína G imobilizada e, em seguida, determinada a 280 nm; a absorvância a 280 nm (A280) pode ser usada para quantificar aproximadamente a Embs. Foi utilizada a electroforese em gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio para confirmar e quantificar as fracções purificadas utilizando albumina sérica de bovino .

Acoplamento da Peroxidase de rábano silvestre a Embs

a Embs purificada foi dialisada contra 100 mM de tampão carbonato/bicarbonato (pH 9.3) a 4°C durante a noite . Os anticorpos foram acoplados à peroxidase de rábano silvestre (HRP) pelas instruções do fabricante (KPL). Cerca de 1,5 mg de HRP foi misturado com 0,5 mg de mAb em 0,5 mL de volume total de HRP conjugação de buffer, delicadamente agitação à temperatura ambiente durante 1 h. A mistura foi deixada à temperatura ambiente por 15 minutos depois de ter adicionado 10 µl do agente redutor, e em seguida, 1 volume de água destilada glicerol foi adicionado para o armazenamento e posterior utilização.O método ELISA foi aplicado para confirmar a reactividade cruzada da HRP conjugada com o antigénio p166W01 e o antigénio p166Chn . Brevemente, poços de microplacas foram revestidos com 100 ng do p166W01 e p166Chn antigen, respectivamente, incubadas por 2 h a 37°C. Isto foi seguido pela remoção revestida de antígenos; 200 µL de fosfato-salino (PBS) contendo 0,1% de albumina de soro bovino foram adicionados em poços e, em seguida, microplacas foram incubadas à temperatura ambiente, agitando suavemente. Duas horas depois, o tampão de bloqueio foi descartado, e os poços foram lavados duas vezes com PBS contendo 0,05% Tween-20 (PBST). Em poços correspondentes foram adicionadas diluições de 2 vezes de Embs conjugadas com HRP que variavam entre 1: 400 e 1: 25,600 em 1% de PBS de caseína, seguidas de 45 minutos de incubação a 37°C; O PBS de caseína foi removido por lavagem 5 vezes com PBST. O substrato líquido de tetrametilbenzidina foi adicionado para o desenvolvimento de cores para incubação a 37°C durante 10 minutos. Finalmente, a densidade óptica (OD) de cada poço foi lida a 450 nm, com um comprimento de onda de referência de 630 nm.

determinação dos títulos de antigénio e mAb

os títulos de antigénio e MAB foram determinados utilizando um ELISA. Inicialmente, foram preparadas diluições em série 2 vezes de MAB conjugadas com HRP variando de 1: 400 a 1: 25,600 em 1% de PBS de caseína, em seguida adicionadas a alvéolos pré-cozidos com diluições em série de p166w01 ou antigénio p166Chn. Seguida de uma incubação de 45 minutos a 37°C, as embas não ligadas foram removidas por lavagem 5 vezes com PBST. Substrato líquido de tetrametilbenzidina foi adicionado para desenvolvimento de cor para uma incubação de 10 minutos a 37 ° C. Finalmente, a OD de cada poço foi lida a 450 nm, com um comprimento de onda de referência de 630 nm, para determinar a diluição que era subsaturante e deu uma leitura OD de aproximadamente 1,0 a 450 nm, com um comprimento de onda de referência de 630 nm.

ensaio de ligação competitiva

as diferentes características dos epitópios neutralizantes comuns e específicos do genótipo do VHE foram investigadas utilizando um ensaio de ligação competitiva em pares estabelecido com Embs neutralizantes comuns e específicos do genótipo . Os métodos foram similares aos procedimentos descritos acima, exceto que p166W01 e p166Chn foram utilizados como antigénio de revestimento, respectivamente, e misturas de mAb conjugado com HRP a duas vezes a concentração e uma concentração saturada de mAb não conjugado foram adicionadas aos alvéolos revestidos. A do foi medida a 450 nm, com um comprimento de onda de referência de 630 nm. A percentagem de inibição foi calculada utilizando a fórmula: 100 × . A concorrência foi considerada positiva se a percentagem de inibição foi superior a 50%.

Resultados

Reactividade Cruzada de HRP Conjugado de mAbs para Heterologous p166 Antigen

O método ELISA foi utilizado para avaliar a reactividade cruzada de HRP conjugado de mAbs para p166W01 e p166Chn antígenos. Os resultados revelaram que, conjugado a HRP 2B1 em diluições de 1: 400, 1: 25,600 reagiu apenas com p166W01, mas não com p166Chn, e conjugado a HRP 4C5 em diluições de 1: 400, 1: 25,600 reagiu apenas com p166Chn. Em contraste, 3G1 e 5G5 conjugados com HRP em diluições de 1: 400 a 1: 25,600 reagiram bem com as 2 proteínas p166(Fig. 1). Estas observações foram semelhantes às constatações anteriores, 2B1 e 4C5 são mAbs específicos do genótipo, enquanto 3G1 e 5G5 são mAbs comuns do genótipo .

a determinação dos títulos do antigénio p166W01 e do mAb conjugado com HRP para o ensaio de ligação competitiva foi utilizada para estabelecer a ligação competitiva do mAbs 2B1, 3G1 e 5G5; os títulos adequados do mAbs e antigénio foram determinados utilizando ELISA. Como demonstrado no quadro 1, após titulação quadrada, quando a diluição do antigénio p166W01 foi 1: 400, 2B1 conjugado com HRP foi 1: 6,400, o valor médio da DO foi próximo de 1, 0. Entretanto, como demonstrado no quadro 2, Quando a diluição do antigénio foi 1: 400, O 5G5 conjugado com HRP e o 3G1 conjugado com HRP foram 1: 6,400 e 1: 12,800, respectivamente, e o valor médio da DO foi próximo de 1, 0.

Quadro 1.

determinação do antigénio p166W01 e dos títulos mAb conjugados com HRP

Quadro 2.

Determinação de p166W01 antigen e conjugado a HRP mAb títulos

Determinação de p166Chn Antigen e Conjugado a HRP mAb Títulos para o Competitivo Ligação Composição

p166Chn antígeno foi utilizado para estabelecer os vínculos competitivos ensaio de mAbs 4C5, 3G1, e 5G5, o bom títulos de mAbs e antigen também foram determinadas utilizando o teste de ELISA. Como demonstrado no quadro 3, após titulação quadrada, quando a diluição do antigénio p166Chn foi de 1: 800, O 4C5 conjugado com HRP foi de 1: 6,400 e o valor médio da DO foi próximo de 1, 0. Entretanto, como demonstrado no quadro 4, Quando a diluição do antigénio foi de 1: 800, as diluições de 5G5 conjugado com HRP e 3G1 conjugado com HRP foram de 1: 6,400 e 1: 12,800, respectivamente; o valor médio da DO foi próximo de 1, 0.

inibição da ligação da Embs a p166W01

os resultados da inibição são apresentados no quadro 5; a ligação do antigénio 2B1 conjugado com HRP ao antigénio p166W01 foi inibida pela inibição não conjugada do 2B1 com 68%. Não se verificou uma inibição significativa entre 2B1 com mAbs 5G5 e 3G1 (27 e 30%). A inibição mais completa foi obtida a partir de mAbs heterólogos 3G1 e 5G5, uma vez que a ligação do HRP-3G1 ao antigénio foi inibida por 5G5 com uma inibição de 61%, O 5G5 conjugado com HRP foi inibido por 3G1 com uma inibição de 99%. A ligação do antigénio HRP-3G1 e HRP-5G5 ao antigénio p166W01 foi também quase completamente inibida por si próprio (inibição de 81 e 80%). Estes resultados sugerem que 3G1 e 5G5 podem compartilhar o mesmo epítopo ou epítopo sobreposto, mas 2B1 provavelmente reconhece um epítopo diferente.

a Inibição da Ligação de mAbs para p166Chn

Os resultados de inibição são mostrados na Tabela 5: ligação do conjugado HRP-4C5 para p166Chn foi inibida por unconjugated 4C5 com 69% de inibição, não houve inibição significativa (25% e 30%) obtido a partir de outros 2 unconjugated mAbs 3G1 e 4C5. No entanto, foi obtida uma taxa de inibição mais elevada da ligação do mAbs 3G1 e 5G5 conjugados com HRP, inibida pela inibição não conjugada do 5G5 e 3G1 com 65 e 76%. A ligação do antigénio 3G1 conjugado com HRP e 5G5 conjugado com HRP ao antigénio p166Chn também foi quase inibida por si só. Estes resultados também sugerem que 3G1 e 5G5 podem compartilhar o mesmo epítopo ou epítopo sobreposto, enquanto 4C5 provavelmente reconhece um epítopo diferente.

Discussão

Desde que a novela suína HEV foi isolado, pela primeira vez , o anti-HEV anticorpos têm sido relatados em muitos animais, revelou HEV infecção entre os animais e os seres humanos, e isto pode ser transmitida dos animais para os seres humanos . A redução da morbilidade e mortalidade da hepatite e dependia da prevenção da vacina e do diagnóstico eficaz. O conhecimento dos epítopos de HEV era essencial para a preparação da vacina e para o desenvolvimento de diagnóstico . A detecção de anticorpos específicos no soro é um dos principais métodos de diagnóstico, e há um número crescente de testes serológicos para a detecção de anticorpos. No entanto, os ensaios utilizados para detectar anticorpos específicos variam consideravelmente em termos de sensibilidade . Alguns testes de diagnóstico comercial baseados em antigénios do genótipo 1 ou 2 não conseguem detectar anticorpos séricos contra os genotipos 3 ou 4 isolados . Pouco se sabe sobre os mecanismos subjacentes à não correspondência dos diferentes ensaios de diagnóstico.

actualmente, um sistema de cultura celular in vitro continua indisponível para investigação em VHE. Portanto, pORF2 contendo a maioria dos locais imunogênicos tem sido amplamente utilizado para o estudo imunológico HEV, com um caráter dependente da conformação . A base estrutural de um imunogénio para induzir anticorpos neutralizantes e protectores é o epítopo neutralizante, que é o principal alvo do desenvolvimento da vacina contra a hepatite E. Nós temos relatado anteriormente que a proteína p166, uma proteína truncada de pORF2, pode modelar epítopo neutralizante HEV(s), e anticorpos levantados contra p166 poderiam neutralizar diferentes genótipos de HEV . Além disso, a vacina contra a hepatite e p239 derivada do HEV do genótipo 1 foi eficaz num ensaio clínico de Fase 3 realizado na província de Jiangsu, China, onde o isolado de HEV epidémico é o genótipo 4 . Estes achados revelaram que o(s) epítopo (s) neutralizante (s) comum (AIS) existe dentro dos diferentes genótipos de HEV. Além do(s) epítopo(s) neutralizante (s) comum (Is), o epítopo específico genótipo também foi confirmado para existir, para preparação e caracterização de mAb .

Para identificar a caracterização do comum e genótipo-epítopos neutralizantes específicos, inibição competitiva do ensaio foi estabelecido de comum com a neutralização mAbs, 3G1 e 5G5, e genótipo neutralizantes específicos mAbs, 2B1 e 4C5, para investigar a concorrência de ligação para p166W01 ou p166Chn antigen e para determinar se o mAbs reconhecer independente, semelhante, ou sobreposição de epítopos.

inicialmente, fluidos ascíticos de mAbs 3G1, 2B1, 5G5 e 4C5 foram produzidos, purificados e conjugados com HRP. O método ELISA foi aplicado para comparar a afinidade de ligação da Embs conjugada com HRP com diferentes genotipos de HEV p166. Os resultados revelaram que o 2B1 conjugado HRP reagiu apenas com o genótipo 1 p166W01, mas não com o p166chn. Similarmente, 4C5 conjugado com HRP reagiu apenas com p166Chn. Em contraste, 3G1 e 5G5 conjugados com HRP reagiram bem contra as proteínas p166 do genótipo 2. Assim, os ensaios de ligação competitivos baseiam-se nos antigénios genótipo 1 e 4 HEV p166. Os resultados de ensaios vinculativos competitivos não são surpreendentes, i.e. que a ligação de 2B1 a p166W01 apenas competia por si só, enquanto 3G1 e 5G5 podiam competir entre si para a ligação a p166W01. Além disso, a ligação de 4C5 a p166Chn foi similar apenas por si só, mas 3G1 e 5G5 poderiam competir entre si para a ligação a p166Chn. Estes achados indicaram que 3G1 e 5G5 reconhecem os mesmos epítopos ou sobrepostos e que 2B1 e 4C5 reconhecem diferentes.

este é o primeiro estudo que investiga as diferentes características dos epítopos de HEV conformacionais comuns e específicos do genótipo. Demonstrámos que epítopos neutralizantes comuns e específicos do genótipo podem ser independentes. Esta descoberta é muito benéfica para demonstrar os mecanismos subjacentes à baixa concordância dos diferentes testes diagnósticos. Outros estudos são de importância crucial para elucidar as diferentes características de neutralização de epitópios de VHE na eficácia do desenvolvimento de diagnóstico e preparação de vacinas.

reconhecimento

este trabalho foi apoiado pela doctoral scientific research foundation of Anhui Medical University (No. 0110037101).

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