O que é Southern Blotting?

Por Hannah Simmons, M. Sc.Revisado por Kate Anderton, B. Sc. (Editor)

Blotting é o processo pelo qual o DNA, RNA ou proteínas são transferidas para uma membrana, a fim de ser visualizado.

crédito: Paul Cowan/.com

o primeiro destes métodos foi Southern Blotting, desenvolvido em 1975 por Edward Southern, e é usado para detectar a sequência de fragmentos de ADN. Desde então, dois outros métodos foram desenvolvidos, chamados de northern and Western blotting. Estes são processos que são usados para identificar seqüências de RNA e proteínas, respectivamente.

Metodologia da coagulação meridional

fragmentos de ADN são inicialmente gerados com enzimas de restrição e separados por tamanho num processo chamado electroforese em gel. O alcalino é então usado para desnaturar o DNA de cadeia dupla, formando cadeias únicas. O DNA é então transferido para uma folha de nitrocelulose ou nylon colocando uma membrana sobre o gel e usando o fluxo de tampão para incentivar o movimento do DNA do gel para a membrana.

fluxo capilar e transferência de vácuo são os dois métodos mais comuns usados para transferir os fragmentos de DNA. No fluxo capilar, o gel é colocado acima do nível do tampão num bloco de apoio com uma membrana colocada em cima. Uma pilha de Toalhas absorventes são então colocadas sobre a membrana e são usadas para absorver o tampão de baixo do gel, levantando os fragmentos de ADN para cima da membrana.

usando transferência a vácuo, a membrana é colocada sob o gel e ambos são submersos em tampão. Um vácuo é então usado para criar um fluxo que puxa os fragmentos de DNA para baixo na membrana.

aquecimento ou radiação UV são então utilizados para garantir que os fragmentos de ADN permanecem ligados à membrana de forma permanente, mantendo ao mesmo tempo a disposição específica do ADN. Sondas rotuladas de cadeia simples são então usadas para se ligar a sequências-alvo.

a folha é incubada com estas sondas e apenas as sondas complementares se ligam. As sondas não complementares são então lavadas a partir da membrana, garantindo que apenas as sondas ligadas permanecem. Estas sondas podem então ser detectadas por autoradiografia para revelar o padrão de hibridação num filme de raios-X.

Applications of Southern blotting

Southern blotting has many different uses. Em primeiro lugar, é possível analisar a reorganização dos genes. Por exemplo, em imunologia este método pode ser usado para identificar os rearranjos clonais dos genes receptores das células T. Em segundo lugar, fragmentos específicos de DNA podem ser identificados a partir de uma mistura de muitos outros fragmentos.

outros exemplos de usos incluem tanto a análise de polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição (RFLP) e a análise de repetição de número variável (VNTR). RFLP usa as diferenças de comprimento em sequências homólogas de DNA para mapear genomas, e pode ser usado em testes forenses e de paternidade.

a análise VNTR utiliza as diferenças de comprimento das sequências nucleótidas repetidas para formar uma impressão digital de ADN, um método que é comumente usado em testes de paternidade e forenses.

estes métodos podem também ser utilizados no diagnóstico da doença causada por mutação, por exemplo anemia falciforme. Esta condição genética é devida a um único polimorfismo nucleotídeo (a A T) no gene beta-globina, resultando em hemoglobina anormal.Blotting do Sul para Síndrome de X Frágil

blots do Sul têm sido usados extensivamente para ajudar a identificar genes com regiões repetidas amplificadas. Estas são sequências curtas e repetitivas no ADN que não codificam produtos genéticos. Um exemplo em que a coagulação do Sul pode ser útil é no diagnóstico da síndrome de X Frágil. Esta condição genética é devido ao aumento na região de repetição CGG/CCG que está localizado dentro do gene FMR1.

este gene contém geralmente entre 5-40 regiões repetidas. Os indivíduos com 55-200 repetições têm uma premutação do gene FMR1, e os indivíduos com >200 repetições têm síndrome X frágil. O aumento de repetições leva à metilação do gene, que inibe a transcrição e impede a produção da proteína FMRP. Esta proteína é necessária para a função normal do sistema nervoso, pelo que a perda da função proteica leva aos sintomas da síndrome X frágil.

no diagnóstico, a enzima de restrição sensível à metilação EclX1 e a enzima ecor1 insensível à metilação são usadas para permitir a diferenciação de alelos metilados e alelos não metilados. Alelos metilados são cortados apenas uma vez para dar um fragmento de DNA singular de 5.1 kb.No entanto, alelos não metilados são cortados duas vezes, produzindo um fragmento de 2,8 kb. Repetições não metiladas de pré-cálculo (< 200) podem, portanto, ser distinguidas das repetições de mutação metilada de cerca de 200 repetições de comprimento, uma vez que a blotting do Sul pode ser usada para identificar os tamanhos dos fragmentos de ADN.

perspectivas futuras

em geral, Southern blotting é um método importante no diagnóstico e estudo da doença (como síndrome de X Frágil e anemia falciforme) e análise do ADN por outras razões (tais como testes forenses e de paternidade).

no entanto, blotting do Sul é muito tecnicamente complexo, caro, laborioso e requer uma grande quantidade de amostra de DNA. Novos métodos estão, portanto, lentamente substituindo Southern blotting, por exemplo PCR em tempo real. Este processo é muito mais fácil e rápido do que o Southern blotting e requer apenas um volume muito pequeno de DNA.

Leitura Adicional

• todo o conteúdo genético
• o que é a genética?
• História da Genética
• Genética e a Expressão do Gene
• Alteração Genética

Escrito por

Hannah Simmons

Hannah é uma médica e ciências da vida do escritor, Mestre em Ciências (M. Sc.) licenciatura da Universidade de Lancaster, reino UNIDO. Antes de se tornar uma escritora, a pesquisa de Hannah focou-se na descoberta de biomarcadores para a doença de Alzheimer e Parkinson. Ela também trabalhou para elucidar ainda mais as vias biológicas envolvidas nestas doenças. Fora de seu trabalho, Hannah gosta de nadar, levando seu cão para um passeio e viajar pelo mundo.

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