Proteinase K
activada pelo cálcio, a enzima digere as proteínas preferencialmente após aminoácidos hidrofóbicos (alifáticos, aromáticos e outros aminoácidos hidrofóbicos). Embora os iões de cálcio não afectem a actividade enzimática, contribuem para a sua estabilidade.As proteínas serão completamente digeridas se o tempo de incubação for longo e a concentração da protease suficientemente elevada. Após a remoção dos iões de cálcio, a estabilidade da enzima é reduzida, mas a actividade proteolítica permanece. Proteinase K tem dois locais de ligação para Ca2+, que estão localizados perto do centro ativo, mas não estão diretamente envolvidos no mecanismo catalítico. A actividade residual é suficiente para digerir proteínas, que normalmente contaminam preparações de ácidos nucleicos. Portanto, a digestão com Proteinase K para a purificação de ácidos nucleicos é geralmente realizada na presença de EDTA (inibição de enzimas dependentes de iões metálicos, tais como nucleases).
Proteinase K também é estável em uma ampla gama de pH (4-12), com um pH ótimo de 8,0.Uma elevação da temperatura de reação de 37 °C para 50-60 °C pode aumentar a atividade várias vezes, como a adição de 0,5–1% de sulfato de sódio dodecilo (SDS) ou cloreto de Guanidínio (3 M), tiocianato de Guanidínio (1 M) e ureia (4 M). As condições acima mencionadas aumentam a actividade da proteinase K, tornando os seus sítios de clivagem do substrato mais acessíveis. Temperaturas acima de 65 ° C, O ácido tricloroacético (TCA) ou os inibidores da protease da serina AEBSF, PMSF ou DFP inibem a actividade. A Proteinase K não ser inibida por Guanidinium cloreto, Guanidinium tiocianato, uréia, Sarkosyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, citrato, iodoacetic ácido, EDTA ou por outros inibidores de serina protease, como Na-Tosyl-Lys Chloromethyl Cetona (TLCK) e Na-Tosyl-Phe Chloromethyl Cetona (TPCK).
Protease K actividade comumente utilizados buffers
| Tampão (pH = 8.0, 50 °C, de 1,25 µg/mL de protease K, 15 min de incubação) | Proteinase K actividade (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris·Cl | 100 |
| 30 mM Tris·Cl; 30 mM de EDTA; 5% de Tween 20; 0,5% De Triton X-100; 800 mM GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris·Cl; 36 mM EDTA; 5% de Tween 20; 0.36% Triton X-100; 735 mM GuHCl | 301 |
| 10 mM Tris·Cl; 25 mM EDTA; 100 mM de NaCl; 0,5% de SDS | 128 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 20 mM de NaCl; 1% Sarkosyl | 74 |
| 10 mM Tris·Cl; 50 mM de KCl; 1,5 mM MgCl2; 0.45% Tween 20; 0,5% De Triton X-100 | 106 |
| 10 mM Tris·Cl; 100 mM EDTA; 0.5% SDS | 120 |
| 30 Mm Tris*Cl; 10 mM EDTA; 1% SDS | 203 |