Purificação de proteínas
a escolha de um material de base é fundamental para a concepção de um processo de purificação. Em uma planta ou animal, uma determinada proteína geralmente não é distribuída homogeneamente por todo o corpo; diferentes órgãos ou tecidos têm concentrações maiores ou menores da proteína. A utilização de apenas tecidos ou órgãos com a maior concentração diminui os volumes necessários para produzir uma determinada quantidade de proteína purificada. Se a proteína está presente em baixa abundância, ou se ele tem um alto valor, os cientistas podem usar a tecnologia de DNA recombinante para desenvolver células que irão produzir grandes quantidades da proteína desejada (isto é conhecido como um sistema de expressão). A expressão recombinante permite que a proteína seja marcada, por exemplo, por uma etiqueta ou um Strep-tag para facilitar a purificação, reduzindo o número de passos de purificação necessários. Uma purificação analítica utiliza geralmente três propriedades para separar proteínas. Em primeiro lugar, as proteínas podem ser purificadas de acordo com os seus pontos isoelétricos através de um gel graduado de pH ou de uma coluna de permuta iónica. Em segundo lugar, as proteínas podem ser separadas de acordo com o seu tamanho ou peso molecular através da cromatografia de exclusão por tamanho ou pela análise SDS-PAGE (dodecilsulfato-poliacrilamida gel electroforese). As proteínas são muitas vezes purificadas através do uso de 2D-PAGE e são então analisadas por impressões digitais em massa de peptídeos para estabelecer a identidade proteica. Isto é muito útil para fins científicos e os limites de detecção de proteínas são actualmente muito baixos e as quantidades de nanogramas de proteínas são suficientes para a sua análise. Em terceiro lugar, as proteínas podem ser separadas por polaridade/hidrofobicidade por cromatografia líquida de alta resolução ou cromatografia de fase reversa.
normalmente um protocolo de purificação de proteínas contém uma ou mais etapas cromatográficas. O procedimento básico na cromatografia é o escoamento da solução que contém a proteína através de uma coluna cheia de vários materiais. Diferentes proteínas interagem de forma diferente com o material da coluna, e podem, portanto, ser separadas pelo tempo necessário para passar a coluna, ou as condições necessárias para eluir a proteína da coluna. Normalmente, as proteínas são detectadas quando saem da coluna pela sua absorvância a 280 nm. Existem muitos métodos cromatográficos diferentes:
cromatografia de exclusão de dimensão
cromatografia pode ser utilizada para separar proteínas em solução ou em condições de desnaturação utilizando géis porosos. Esta técnica é conhecida como cromatografia de exclusão por tamanho. O princípio é que moléculas menores têm que atravessar um volume maior em uma matriz porosa. Consequentemente, as proteínas de uma determinada gama de dimensões necessitarão de um volume variável de eluente (solvente) antes de serem recolhidas na outra extremidade da coluna de gel.
no contexto da purificação de proteínas, o eluente é normalmente agrupado em diferentes tubos de ensaio. Todos os tubos de ensaio que não contenham vestígios mensuráveis da proteína a purificar são rejeitados. A solução restante é, portanto, feita da proteína para purificar e quaisquer outras proteínas de tamanho semelhante.
separação baseada na carga ou hidrofóbica edit
cromatografia de interacção hidrofóbica
o meio HIC é anfifílico, com regiões hidrofóbicas e hidrofílicas, permitindo a separação de proteínas com base na sua hidrofobicidade superficial. As proteínas alvo e as espécies agregadas de seus produtos tendem a ter diferentes propriedades hidrofóbicas e removê-las via HIC purifica ainda mais a proteína de interesse. Além disso, o ambiente usado normalmente emprega condições de desnaturação menos duras do que outras técnicas de cromatografia, ajudando assim a preservar a proteína de interesse em seu estado nativo e funcional. Em água pura, as interações entre a resina e as regiões hidrofóbicas de proteína seriam muito fracas, mas esta interação é reforçada pela aplicação de uma amostra de proteína à resina HIC em tampão de alta resistência iônica. A resistência iónica do tampão é então reduzida a proteínas elúticas, por ordem de diminuição da hidrofobicidade.
cromatografia de permuta iónica
cromatografia de permuta iónica separa compostos de acordo com a natureza e o grau da sua carga iónica. A coluna a utilizar é seleccionada de acordo com o seu tipo e resistência de carga. As resinas de troca de anião têm uma carga positiva e são usadas para reter e separar compostos negativamente carregados (aniões), enquanto as resinas de troca de catião têm uma carga negativa e são usadas para separar moléculas positivamente carregadas (catiões).
antes do início da separação, bombeia-se um tampão através da coluna para equilibrar os iões carregados opostos. Após a injecção da amostra, as moléculas solúveis trocam-se com os iões-tampão à medida que cada uma concorre pelos locais de ligação da resina. O comprimento de retenção para cada soluto depende da força de sua carga. Os compostos mais fracamente carregados irão fluir primeiro, seguidos por aqueles com cargas sucessivamente mais fortes. Devido à natureza do mecanismo de separação, pH, tipo de tampão, concentração de tampão, e temperatura, todos desempenham papéis importantes no controle da separação.
a cromatografia de troca iónica é uma ferramenta muito poderosa para a purificação de proteínas e é frequentemente utilizada em separações analíticas e preparatórias.
electroforese de fluxo livre
eletroforese de fluxo livre (FFE) é uma técnica de eletroforese livre de portadoras que permite a separação de proteínas preparativas em uma corrente de tampão laminar usando um campo elétrico ortogonal. Ao fazer uso de um gradiente de pH, que pode, por exemplo, ser induzido por ampolitos, esta técnica permite separar as isoformas proteicas até uma resolução de < 0.02 delta-pI.Artigo principal: A cromatografia de afinidade
a cromatografia de afinidade é uma técnica de separação baseada na conformação molecular, que frequentemente utiliza resinas específicas de Aplicação. Estas resinas têm ligantes ligados a suas superfícies que são específicas para os compostos a serem separados. Mais frequentemente, estes ligantes funcionam de uma forma semelhante à das interacções anticorpo-antigénio. Esta” fechadura e chave ” encaixam entre o ligante e o seu composto alvo, tornando-o altamente específico, gerando frequentemente um único pico, enquanto todo o resto da amostra não é retido.Muitas proteínas de membrana são glicoproteínas e podem ser purificadas por cromatografia de afinidade de lectina. As proteínas detergentes-solubilizadas podem ligar-se a uma resina cromatográfica que foi modificada para ter uma lectina covalentemente ligada. As proteínas que não se ligam à lectina são lavadas e, em seguida, as glicoproteínas especificamente ligadas podem ser eluídas adicionando uma elevada concentração de um açúcar que concorre com as glicoproteínas ligadas no local de ligação da lectina. Algumas lectinas têm elevada afinidade de ligação aos oligossacáridos das glicoproteínas que são difíceis de competir com os açúcares, e as glicoproteínas ligadas precisam de ser libertadas através da desnaturação da lectina.
cromatografia de Imunoafinidade
cromatografia de Imunoafinidade utiliza a ligação específica de um antigénio de anticorpos para purificar selectivamente a proteína-alvo. O procedimento envolve a imobilização de uma proteína a um substrato sólido (por exemplo, uma conta porosa ou uma membrana), que então liga seletivamente o alvo, enquanto tudo o resto flui através. A proteína-alvo pode ser eluída alterando o pH ou a salinidade. O ligante imobilizado pode ser um anticorpo (tal como a imunoglobulina G) ou pode ser uma proteína (tal como a proteína a). Como este método não envolve engenharia em uma tag, ele pode ser usado para proteínas de fontes naturais.
purificação de um proteinEdit marcado
outra forma de marcar as proteínas é engendrar uma marca de péptido antigénio na proteína, e depois purificá-la numa coluna ou incubando com uma resina solta que é revestida com um anticorpo imobilizado. Este procedimento em particular é conhecido como imunoprecipitação. A imunoprecipitação é bastante capaz de gerar uma interação extremamente específica que geralmente resulta na ligação apenas da proteína desejada. As proteínas marcadas purificadas podem então ser facilmente separadas das outras proteínas em solução e depois eluídas de volta para uma solução limpa.
quando as etiquetas já não são necessárias, podem ser clivadas por uma protease. Isto frequentemente envolve a engenharia de um local de clivagem da protease entre a etiqueta e a proteína.Hplcedit
High performance liquid chromatography or high pressure liquid chromatography is a form of chromatography applying high pressure to drive the solutes through the column faster. Isto significa que a difusão é limitada e a resolução é melhorada. A forma mais comum é HPLC de “fase invertida”, onde o material da coluna é hidrofóbico. As proteínas são eluídas por um gradiente de quantidades crescentes de um solvente orgânico, como o acetonitrilo. As proteínas eluem de acordo com a sua hidrofobicidade. Após a purificação por HPLC a proteína está em uma solução que só contém compostos voláteis, e pode facilmente ser liofilizado. A purificação do HPLC resulta frequentemente na desnaturação das proteínas purificadas, pelo que não é aplicável às proteínas que não se repitam espontaneamente.