Tirosinase
8.14.2.2.4 Tirosinase (EC 1.14.18.1) e catecol oxidase (CE 1.10.3.1)
Tirosinase, que pertence a uma proteína da família, tendo o centro catalítico formado por dinuclear tipo-3 de cobre, catalisa a orthohydroxylation de monophenol e a consequente oxidação do diphenolic produto resultante quinona.Uma série de reacções ocorre sob a redução concomitante de oxigénio molecular para a água. O produto quinone é um precursor reativo para a síntese de pigmentos da melanina. A tirosinase, que está contida em vegetais, frutas e cogumelos, é uma enzima chave na browning que ocorre em cima de nódoas negras ou armazenamento de longo prazo. Em mamíferos, a enzima é responsável por anomalias da pigmentação da pele, tais como manchas e defeitos.Deste modo, a tirosinase é bastante significativa nos domínios da agricultura e da indústria. Na indústria cosmética, o desenvolvimento e o rastreio de inibidores potentes da tirosinase são especialmente atraentes.
tirosinase is classified into the type-3 copper protein family, as are catecol oxidase and the respiratory pigment hemocianin. Durante a reação catalítica, o centro de Cobre Tipo-3 da tirosinase existe em três formas redox.A forma desoxi(Cu(I)–Cu (I)) é uma espécie reduzida, que se liga ao oxigênio para dar a forma oxi(Cu(II)–O22–Cu (II)). Na forma oxi, o oxigênio molecular é ligado como peróxido em um modo de ponte lateral μ-η2:η2, que desestabiliza a ligação O-O e a ativa. A forma met (Cu(II)–Cu(II)) é assumida como uma forma enzimática de repouso, onde iões Cu(II) são normalmente ligados a um pequeno ligando, como uma molécula de água ou íon hidróxido.
a catecol oxidase oxida Orto-difenóis às quinonas correspondentes, mas carece de actividade monooxigenase ou cresolase. A hemocianina atua como um portador de oxigênio em artrópodes e moluscos.Foram determinadas as estruturas cristalinas da tirosinase de Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268 e da catecol oxidase de batata doce Ipomoea batatas180. Eles confirmam que a coordenação do local de Cobre Tipo-3 na tirosinase e na catecol oxidase é muito semelhante à encontrada na hemocianina. Isto tinha sido deduzido antes da semelhança das propriedades espectroscópicas e uma comparação de muitas estruturas primárias de tirosinase e hemocianina.181-183 com base na fonte biológica das proteínas podem ser identificadas sete diferentes organizações de domínio. As oxidases de catecol vegetal de diferentes organismos têm uma identidade sequencial de cerca de 40-60%. A identidade sequencial entre as hemocianinas catecol oxidases e mulluscan é de cerca de 35% sobre quase todo o comprimento das sequências. Em contraste, a identidade sequencial entre as catecol oxidases vegetais e outras proteínas de Cobre Tipo-3 de qualquer fonte não-vegetal é limitada às duas regiões de ligação ao cobre.
as duas regiões de ligação ao cobre apresentam a conservação mais elevada em todas as proteínas de Cobre Tipo-3. Especialmente a Cria de ligação à região é altamente conservada, enquanto a região de ligação à CuA mostra mais variedade de sequência e tem sido responsabilizada pelas diferentes funções da tirosinase, catecol oxidase e hemocianina.
a estrutura global da tirosinase a partir de S. castaneoglobisporus em complexo com quadro de leitura aberto ORF378 é mostrado na Figura 23. A tirosinase toma estruturas α-helicoidais com o núcleo da enzima, que é formada por um feixe de quatro hélices. O centro catalítico de cobre dinuclear está alojado no feixe helicoidal (Figura 23). Cada um dos dois íons de cobre em um local ativo é coordenado por três seus resíduos (Figura 24), que são derivados das quatro hélices do feixe α exceto His54. Um íon de cobre (designado CuA) é coordenado por His38, His54 e His63. His38 e His63 estão localizados no meio de α2 e α3, respectivamente. O segundo íon de cobre (CuB) é coordenado por His190, His194 e His216. Os resíduos His190 e His194 estão no início e no meio da α6, respectivamente, e His216 está no meio de α7. Este centro dicopper está localizado na parte inferior da concavidade grande como uma bolsa de ligação de substrato putativo, que é formada pelos resíduos hidrofóbicos. Além da estrutura helicoidal, a tirosinase tem algumas estruturas β, como julgada a partir dos ângulos de torção da coluna vertebral. Nestes, apenas as linhas β – N E C-terminal formam uma estrutura de folha.
Figura 23. Diagrama de fita da tirosinase de Streptomyces castaneoglobisporus em complexo com ORF378 (código PDB: 1WX3). A tirosinase e o ORF378 são apresentados em rosa e framboesa, respectivamente. Os iões de cobre CuA e CuB são representados como esferas amarelas; preparados com PyMOL (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
Figura 24. The met form of the active center of tyrosinase from Streptomyces castaneoglobisporus( PDB-code: 1WX3); prepared with PyMOL (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
Embora a sequência de aminoácidos da tirosinase tem apenas 25.3 e de 26,0% identidades com as do I. batatas catecol oxidase180 e a odg domínio do Polvo dofleini hemocyanin,184, respectivamente, a sua estrutura geral é bastante semelhante à deles. Entre estas três proteínas, observa-se um elevado grau de conservação no domínio central composto pelo feixe α. A tirosinase e hemocianinas de Panulirus interruputus185 e L. polyphemus66 não mostram homologia significativa e nenhuma semelhança em suas estruturas, mas os domínios do núcleo catalítico destas proteínas são superimposíveis.
para a tirosinase de S. castaneoglobisporus cinco estados diferentes do local ativo podem ser caracterizados em estruturas de cristal, nomeadamente, forma livre de Cobre, Forma met I, Forma met II, deoxi e oxi. In crystal structures of catecol oxidase from I. batatas the met and deoxy states as well as an in inibidor complex have been elucidated. No estado de tem [Cu(II), Cu(II)] os dois íons cuprícos estão a uma distância de 2.9 Å, cada um deles sendo coordenado por três histidines. Elas são unidas por outro átomo, provavelmente um íon hidróxido, a uma distância de cerca de 1,8 Å de cada íon cúprico, de modo que cada um deles tem um número de coordenação de 4 (ver Figura 24, que mostra a mesma situação para a tirosinase a partir de S. castaneoglobisporus). No estado de desoxi ou reduzido, ambos os átomos de cobre estão no estado de oxidação +1. A distância cobre–cobre é de 4.4 Å. Os números de coordenação são 4 para CuA (três ligandos de histidina e uma molécula de água de coordenação) e 3 para CuB (três ligandos de histidina). A esfera de Coordenação é distorcida piramidal trigonal para CuA e planar quadrado para CuB (o local de coordenação ocupado pela ponte OH− no estado met está vago). No complexo inibidor com feniltiourea (PTU), a distância cobre–cobre aumenta para 4,2 Å com o átomo de enxofre de PTU substituindo a ponte hidroxi do estado met. As esferas de coordenação dos dois coppers permanecem similares às do estado met, mas há mudanças conformacionais nos resíduos do local ativo. A mudança mais significativa é uma rotação do anel aromático de Fe261 (numeração da catecol oxidase).
em comparação com o estado de tem, os resíduos de coordenação têm apenas posições ligeiramente diferentes no estado reduzido, indicando uma bolsa bastante rígida. As mudanças na coordenação estão associadas com os movimentos dos átomos de cobre no bolso. O complexo inibidor mostra que Phe261 está localizado acima do local ativo como um portal, que roda após a ligação do inibidor. Assim, o acesso do substrato ao centro catalítico de metal parece ser controlado por este “resíduo de portal”.
o mecanismo catalítico da tirosinase foi estudado em detalhe por Solomon et al.178 Salomão propôs um mecanismo tanto para as atividades da cresolase quanto da catecolase da tirosinase (Figura 25). Este mecanismo sugere que o estado de oxi é o ponto de partida da atividade da cresolase (círculo interno). Este estado está presente na forma de repouso da tirosinase numa proporção de cerca de 15% (85% do Estado tem). Um substrato de monofenol liga-se ao estado oxi e é monooxigenado ao o-difenol. Este difenol liga-se posteriormente ao centro de cobre da met tirosinase em um modo de ligação bidentato proposto com base em um composto modelo.188 oxidação do substrato de difenol leva ao estado reduzido do centro de cobre dinuclear. Reoxidação do estado reduzido para o estado oxi ocorre por ataque de dioxígeno e fecha o ciclo catalítico.
Figura 25. Mecanismo de cresolase e actividade da catecolase da tirosinase e da catecol oxidase desenvolvido com base numa proposta inicial de Salomão e colegas de trabalho178 e incluindo resultados mais recentes.186.187 reproduzida a partir de C. Gerdemann; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Chem. Res. 2002, 35, 183-191, with permission from American Chemical Society.
o mecanismo da atividade da catecolase (círculo exterior) começa a partir dos estados de oxi e met. Um substrato de difenol liga-se ao estado met (por exemplo), seguido pela oxidação do substrato à primeira quinona e a formação do estado reduzido da enzima. A ligação do dioxígeno leva ao estado oxi, que é posteriormente atacado pela segunda molécula de difenol. Oxidação para a segunda quinona forma o estado met novamente e fecha o ciclo catalítico.Os mecanismos alternativos de reação incluem um mecanismo radical proposto por Kitajima e Morooka189 e um mecanismo que envolve um intermediário Cu (III) baseado em medições de compostos modelo.Com base na estrutura cristalina do complexo inibidor da catecol oxidase–PTU, foi sugerida a ligação do substrato ao monodentato para a catecol oxidase.180 radicalidade de Um mecanismo, tal como proposto para os fracos catecholase atividade encontrada em Octopus vulgaris hemocyanin,191 também é possível para catecol oxidase, devido à forte relação estrutural entre a catecol oxidase de I. batatas e odg hemocyanin como descrito acima.
a diferença distinta entre a catecol oxidase e a tirosinase ainda não foi explicada. Foi encontrada e estudada uma fase de latência da actividade da tirosinase na monofenolase, que é proposta como resultado da inibição temporária do Estado de Tem da tirosinase por excesso do substrato do monofenol (Figura 25).A atividade da Monofenolase aumenta quando o produto difenol desloca o monofenol da tirosinase e permite a continuação do ciclo catalítico. A catecol oxidase na sua forma isolada está presente exclusivamente no estado met e é também inibida pelo fenol. Foi, portanto, sugerido que a falta do estado oxi é a razão pela qual a catecol oxidase carece de actividade da cresolase. Como a oxi catecol oxidase também não mostra atividade monooxigenase, esta explicação não parece inteiramente satisfatória. Outra razão possível é que o acesso à CuA, que foi proposto ser necessário para a oxigenação dos monofenóis,192 é bloqueado na estrutura cristalina da catecol oxidase de I. batatas.