Încrucișări genetice

o cruce genetică este împerecherea intenționată a doi indivizi care rezultă în combinația de material genetic la descendenți. Încrucișările pot fi efectuate în multe sisteme model—inclusiv plante, drojdii, muște și șoareci—și pot fi folosite pentru a diseca procesele genetice sau pentru a crea organisme cu trăsături noi.

acest videoclip va acoperi câteva dintre principiile încrucișărilor genetice, va examina o metodă de efectuare a încrucișărilor cunoscută sub numele de analiză tetrad și va discuta mai multe aplicații ale acestei tehnici.

în primul rând, să introducem principiile de bază ale moștenirii care fac posibile încrucișările genetice.

fenotipul unui organism, sau compoziția trăsăturilor, este influențată de structura sa genetică sau de genotip. În majoritatea organismelor care se reproduc sexual, generația parentală produce celule gamete haploide, care au o copie a fiecărui cromozom distinct. Acestea fuzionează apoi în timpul împerecherii pentru a produce un descendent diploid cu două copii omoloage ale fiecărui cromozom. Dacă ambii cromozomi conțin aceeași alelă sau formă variantă a unei gene, atunci organismul este „homozigot” la acel loc genetic; în caz contrar, este „heterozigot”.”

pentru a începe din nou ciclul, organismul diploid generează din nou gameți haploizi prin meioză. În timpul acestui proces, cei doi cromozomi omologi suferă „recombinare”, unde se schimbă biți de secvențe echivalente între pereche. Acest proces amestecă alelele parentale moștenite de fiecare descendent, crescând astfel diversitatea lor genetică.

unul dintre primii oameni care au efectuat cruci genetice sistematice a fost „părintele geneticii”, Gregor Mendel. Folosind planta de mazăre ușor de manipulat și examinând o serie de trăsături cu modele consistente de moștenire, Mendel a reușit să obțină trei legi de bază ale moștenirii care ar sta la baza geneticii.

prima lege a lui Mendel este legea uniformității, care afirmă că descendenții heterozigoți ai primei generații sau F1 a doi indivizi homozigoți vor avea fenotipul unui singur părinte. Alela care stabilește acest fenotip se numește „dominantă”, în timp ce alela „ascunsă” este ” recesivă.”Acum știm că relațiile de dominanță sunt adesea mai puțin clare, cu cazuri precum dominanța incompletă, unde heterozigoții exprimă un fenotip amestecat; și codominanța, unde sunt afișate ambele fenotipuri.

Legea segregării afirmă că o alelă este repartizată aleatoriu fiecărui GAMET. Observând că descendenții F2 din auto-fertilizarea indivizilor heterozigoți F1 au afișat un 3:1 raportul fenotipic, dar că doi dintre indivizii dominanți fenotipic sunt de fapt heterozigoți, Mendel a dedus că cele două alele parentale trebuie moștenite separat. Astăzi, știm că segregarea are loc în timpul meiozei, când cei doi cromozomi omologi ai părintelui diploid sunt împărțiți aleatoriu în celule fiice haploide, fiecare moștenind una dintre cele două alele.

a treia lege a lui Mendel este legea sortimentului Independent, care afirmă că trăsăturile individuale sunt moștenite independent. Acum știm că independența absolută există doar pentru trăsăturile controlate de gene pe cromozomi separați din setul haploid, care sunt distribuite independent celulelor fiice în timpul meiozei. Pentru două gene de pe același cromozom, distanța dintre ele este invers proporțională cu probabilitatea ca acestea să fie recombinate pe cromozomi omologi diferiți și, prin extensie, cât de probabil sunt moștenite împreună la aceiași descendenți. Prin urmare, analiza celor patru produse meiotice ale unui organism diploid oferă oamenilor de știință o modalitate de a cartografia locația genelor.

după revizuirea principiilor din spatele încrucișărilor genetice, să aruncăm o privire la un protocol pentru analiza tetrad.

această tehnică este aplicată de obicei anumitor alge sau ciuperci cu o singură celulă, cum ar fi drojdia, pentru a diseca cele patru produse meiotice haploide sau spori, care la aceste specii rămân împreună ca „tetrad” într-un singur corp celular.

pentru a efectua analiza tetrad în drojdie, tulpinile dorite sunt cultivate mai întâi pe medii adecvate. Celulele de drojdie din coloniile individuale sunt lăsate să se împerecheze, de exemplu prin dungarea fiecărei tulpini într-un model încrucișat pe o placă nouă. Această placă este apoi placată cu replică pe medii selective pentru a izola numai produsul diploid al Crucii.

celulele diploide selectate sunt cultivate pe medii sărace în nutrienți pentru a induce sporularea și formarea tetradului. Asci, care sunt structurile care dețin tetradele sporilor, sunt digerate în soluții care conțin enzima zymolyase. După digestie, asci individuali sunt manipulați folosind un microscop cu disecție tetradică. Acestea sunt aranjate în locații specifice pe o placă de creștere și perturbate pentru a elibera sporii individuali. Acestea pot fi plasate într-un model de tip grilă, în cazul în care fiecare sport ar genera o colonie individuală, care pot fi analizate în continuare.

acum, că știți cum se efectuează analiza tetrad, să examinăm câteva dintre numeroasele aplicații sau modificări ale acestei tehnici.

disecția manuală a tetradelor consumă mult timp, iar cercetătorii au conceput alternative de mare viteză, cum ar fi secvențierea tetradelor cu coduri de bare. În această metodă, descendența diploidă a unei cruci de drojdie a fost transformată cu o bibliotecă de plasmide, fiecare conținând o secvență scurtă, unică, cunoscută sub numele de „cod de bare”, care acționează ca un identificator pentru fiecare descendent. Plasmidele exprimă, de asemenea, GFP, permițând selectarea drojdiei asci prin citometrie în flux și sortată pe plăci de agar. ASCII au fost lizați în masă pe plăci, iar sporii au fost lăsați să crească în colonii mici. Coloniile au fost apoi distribuite aleatoriu pe plăci cu 96 de puțuri pentru genotipare. Codul de bare de secvență unic permite cercetătorilor să grupeze cele patru colonii care au apărut din spori din fiecare tetrad.

încrucișările genetice pot fi, de asemenea, utilizate pentru a genera celule de drojdie cu un număr mare de ștergeri de gene. În procesul monstru verde, drojdia mutantă haploidă care transportă diferite ștergeri de gene marcate de GFP sunt împerecheate și sporulate. Acești descendenți haploizi, dintre care unii poartă ștergeri moștenite de la ambii părinți, sunt sortați prin citometrie în flux activată prin fluorescență, unde s-a demonstrat că intensitatea GFP se corelează cu numărul de ștergeri prezente într-o anumită tulpină de drojdie. Aceste celule selectate au fost apoi cultivate și re-încrucișate. Repetarea acestui ciclu a generat tulpini de drojdie care conțin numeroase ștergeri.

în cele din urmă, încrucișările genetice au fost adaptate pentru a fi utilizate în multe sisteme model, cum ar fi parazitul intracelular Plasmodium care provoacă malarie. Deoarece parazitul se poate reproduce doar în alte celule, toate etapele de trecere trebuie efectuate la șoareci sau țânțari, respectiv gazda naturală și vectorul parazitului. Aici, șoarecii au fost infectați cu două tulpini unice de Plasmodium în stadiul parazitului sanguin. Paraziții au fost apoi transferați în țânțari prin hrănirea sângelui și, odată ajunși în interior, s-au maturizat în gameți care s-ar fertiliza pentru a forma zigoți diploizi. Sporozoiții maturi au fost apoi recoltați de la țânțar și folosiți pentru a infecta șoarecii na-uri, unde paraziții au fost propagați pentru izolarea descendenților încrucișați de interes.

tocmai ați vizionat videoclipul lui JoVE despre cruci genetice. În acest videoclip, am introdus principiile moștenirii, modul în care încrucișările genetice în unele organisme pot fi analizate cu disecția tetradică și câteva aplicații actuale. Ca întotdeauna, mulțumesc pentru vizionare!