Blog Proteomics Creativ

secvența aminoacizilor dintr-o proteină sau peptidă poate fi identificată prin degradarea Edman, care a fost dezvoltată de Pehr Edman. Această metodă poate eticheta și scinda peptida de la N-terminal fără a perturba legăturile peptidice dintre alte reziduuri de aminoacizi. Reacția de degradare Edman a fost automatizată în 1967 de Edman și Beggs. În zilele noastre, degradarea automată Edman (secvențiatorul de proteine) este utilizată pe scară largă și poate secventa peptide de până la 50 de aminoacizi.

degradarea ciclică a peptidelor pe baza reacției fenilizotiocianatului cu gruparea amino liberă a reziduului n-terminal, astfel încât aminoacizii sunt îndepărtați pe rând și identificați ca derivați ai feniltiohidantoinei. Vorbind la procesul specific, o peptidă neîncărcată reacționează cu fenilizotiocianat (PITC) la capătul amino în condiții ușor alcaline pentru a da un derivat de feniltiocarbamoil (peptidă PTC). Apoi, în condiții acide, sulful tiocarbonil al derivatului atacă carbonul carbonil al aminoacidului n-terminal. Primul aminoacid este scindat ca derivat de anilinotiazolinonă (ATZ-aminoacid), iar restul peptidei poate fi izolat și supus următorului ciclu de degradare. Odată format, acest derivat de tiazolonă este mai stabil decât derivatul de feniltiocarbamil. Aminoacidul ATZ este apoi îndepărtat prin extracție cu acerat de etil și transformat într-un derivat de feniltiohidantoină (PTH-aminoacid). Și cromatografia poate fi utilizată pentru a identifica reziduul PTH generat de fiecare ciclu.

în ceea ce privește degradarea Edman automatizată, proteinele pot fi analizate prin aplicarea lor în soluție pe un filtru TFA și apoi încărcate pe instrumentul de secvențiere Edman. Proteinele din amestecuri sunt mai întâi separate prin geluri 1D sau 2D și apoi șterse pe o membrană PVDF. Proteinele sunt detectate prin colorarea coomassie blue, amido black sau Poncau s, iar proteinele de interes sunt decupate și piesa de membrană PVDF încărcată pe secvențiatorul Edman.

odată cu dezvoltarea spectrometriei de masă, utilizarea secvențierii degradării Edman a început să scadă. Cu toate acestea, stills rămâne metodele pentru mai multe tipuri de aplicații de analiză structurală a proteinelor. Poate fi utilizat pentru a verifica limita N-terminală a proteinelor recombinante sau pentru a determina n-terminalul domeniilor rezistente la protează, în special atunci când proteina sau domeniul este >40 până la 80 kDa sau nu poate fi ușor purificat. De asemenea, poate fi utilizat pentru a identifica noul situs de clivaj n-terminal și proteolitic în fragmentele de proteine. În plus, în ceea ce privește unele proteine și peptide noi în care bazele de date de secvență nu sunt disponibile pentru căutarea bazei de date MS/MS, degradarea Edman poate fi utilizată pentru analiză.

aminoacidul n-terminal al proteinei poate fi scindat. Astfel, în acest proces, primul ciclu identifică astfel aminoacidul n-terminal exact. În plus, deoarece aminoacizii eliberați sunt identificați și cuantificați prin cromatografie, aminoacizii cu greutate moleculară identică pot fi identificați. De exemplu, izoleucina și leucina au o masă de 113 Da, dar au timp de retenție diferit. Mai mult, secvențierea Edman poate fi efectuată pe bloturi PVDF din geluri 1D și 2D, ceea ce permite secvențierea N-terminală a proteinelor din amestec. Cu toate acestea, secvențierea degradării Edman nu va fi disponibilă atunci când peptida al cărei n-terminal a fost modificat chimic, cum ar fi acetilarea. Și, deoarece PITC nu poate reactiva cu aminoacidul non-VIII, secvențierea se va opri dacă se întâlnește un aminoacid non-VIII ca acidul izoaspartic. Mai mult, proteinele mai mari nu pot fi secvențiate prin secvențierea Edman.

la Proteomics Creative, platforma noastră profesională de secvențiere a proteinelor oferă analiza secvenței n-terminale prin degradarea Edman sau spectrometria de masă (MS), cu avantaje complementare între ele. Echipa noastră de experți cu o vastă experiență vă poate ajuta să înțelegeți ceea ce încercați să investigați și să vă îndepliniți cerințele. În plus, putem oferi alte servicii de identificare a proteinelor, inclusiv:

• serviciul de amprentare a masei peptidice (PMF)
• analiza secvenței peptidelor sau proteinelor
• serviciul de analiză a secvenței proteice de novo
• serviciul de identificare a proteinelor din pușcă
• serviciul de proteomică cu membrană