Ce este Southern Blotting?

de Hannah Simmons, M. Sc.revizuit de Kate Anderton, B.Sc. (Editor)

Blotting este procesul prin care ADN-ul, ARN-ul sau proteinele sunt transferate pe o membrană pentru a fi vizualizate.

Credit: Paul Cowan/.com

prima dintre aceste metode a fost Southern Blotting, dezvoltat în 1975 de Edward Southern, și este folosit pentru a detecta secvența de fragmente de ADN. De atunci, au fost dezvoltate alte două metode, numite blotting nordic și Occidental. Acestea sunt procese care sunt utilizate pentru a identifica secvențele de ARN și proteine, respectiv.

metodologia Southern blotting

fragmentele de ADN sunt inițial generate cu enzime de restricție și separate prin dimensiune într-un proces numit electroforeză în gel. Alcalina este apoi utilizată pentru a denatura ADN-ul dublu catenar, formând fire unice. ADN-ul este apoi transferat pe o foaie de nitroceluloză sau nailon prin plasarea unei membrane peste gel și folosind fluxul de tampon pentru a încuraja mișcarea ADN-ului de la gel la membrană.

fluxul capilar și transferul în vid sunt cele două metode cele mai comune utilizate pentru a transfera fragmentele de ADN. În fluxul capilar, gelul este plasat deasupra nivelului tamponului pe un bloc de susținere cu o membrană plasată deasupra. Un teanc de prosoape absorbante sunt apoi plasate peste membrană și sunt utilizate pentru a absorbi tamponul de sub gel, ridicând fragmentele de ADN pe membrană.

folosind transferul în vid, membrana este plasată sub gel și ambele sunt scufundate în tampon. Un vid este apoi utilizat pentru a crea un flux care trage fragmentele de ADN în jos pe membrană.

încălzirea sau radiațiile UV sunt apoi utilizate pentru a se asigura că fragmentele de ADN rămân atașate permanent de membrană, menținând în același timp dispunerea specifică a ADN-ului. Sondele etichetate monocatenare sunt apoi utilizate pentru a se lega de secvențele țintă.

foaia este incubată cu aceste sonde și se leagă numai sondele complementare. Sondele non-complementare sunt apoi spălate din membrană, asigurându-se că rămân doar sondele legate. Aceste sonde pot fi apoi detectate prin autoradiografie pentru a dezvălui modelul de hibridizare pe un film cu raze X.

aplicații ale Southern blotting

Southern blotting are multe utilizări diferite. În primul rând, rearanjările genelor pot fi analizate. De exemplu, în imunologie această metodă poate fi utilizată pentru a identifica rearanjamentele clonale ale genelor receptorilor celulelor T. În al doilea rând, fragmente specifice de ADN pot fi identificate dintr-un amestec de multe alte fragmente.

alte exemple de utilizări includ atât polimorfismul lungimii fragmentului de restricție (RFLP), cât și analiza repetării în tandem a numărului variabil (VNTR). RFLP folosește diferențele de lungime în secvențele ADN omoloage pentru a cartografia genomii și poate fi utilizat în testele medico-legale și de paternitate.

analiza VNTR utilizează diferențele de lungime a secvențelor nucleotidice repetate pentru a forma o amprentă ADN, o metodă care este frecvent utilizată în paternitate și testarea criminalistică.

aceste metode pot fi, de asemenea, utilizate în diagnosticul bolilor cauzate de mutații, de exemplu anemia falciformă. Această afecțiune genetică se datorează unui singur polimorfism nucleotidic (de la A la T) în gena beta-globinei, rezultând hemoglobină anormală.

Southern blotting pentru sindromul X fragil

bloturile sudice au fost utilizate pe scară largă pentru a ajuta la identificarea genelor cu regiuni repetate amplificate. Acestea sunt secvențe scurte, repetitive în ADN care nu codifică produsele genetice. Un exemplu în care Southern blotting poate fi util este în diagnosticul sindromului X fragil. Această afecțiune genetică se datorează creșterii regiunii repetate CGG/CCG care se află în cadrul genei FMR1.

această genă conține de obicei între 5-40 de regiuni repetate. Persoanele cu 55-200 de repetări au o premutație a genei FMR1, iar persoanele cu >200 de repetări au sindromul X fragil. Creșterea repetărilor duce la metilarea genei, care inhibă transcripția și previne producerea proteinei FMRP. Această proteină este necesară pentru funcționarea normală a sistemului nervos, prin urmare pierderea funcției proteice duce la simptomele sindromului X fragil.

în diagnostic, enzima de restricție sensibilă la metilare EclX1 și enzima insensibilă la metilare EcoR1 sunt utilizate pentru a permite diferențierea alelelor metilate și a alelelor nemetilate. Alelele metilate sunt tăiate o singură dată pentru a da un fragment ADN singular de 5,1 kb.

cu toate acestea, alelele nemetilate sunt tăiate de două ori, producând un fragment de 2,8 kb. Repetările premutației nemetilate (<200) pot fi, prin urmare, distinse de repetările mutației metilate de aproximativ 200 de repetări lungi, deoarece Southern blotting poate fi utilizat pentru a identifica dimensiunile fragmentelor ADN.

perspective viitoare

în general, Southern blotting este o metodă importantă în diagnosticul și studiul bolilor (cum ar fi sindromul X fragil și anemia celulelor secera) și analiza ADN-ului din alte motive (cum ar fi testarea criminalistică și de paternitate).

cu toate acestea, Southern blotting este foarte complex din punct de vedere tehnic, scump, laborios și necesită o cantitate mare de probă de ADN. Prin urmare, noile metode înlocuiesc încet Southern blotting, de exemplu PCR în timp real. Acest proces este mult mai ușor și mai rapid decât Southern blotting și necesită doar un volum foarte mic de ADN.

Lectură suplimentară

• tot conținutul geneticii
• ce este genetica?
• istoria geneticii
• genetica și expresia genelor
• schimbarea genetică

scris de

Hannah Simmons

Hannah este un scriitor de științe medicale și de viață cu un Master Of Science (M.Sc.) diplomă de la Universitatea Lancaster, MAREA BRITANIE. Înainte de a deveni scriitor, cercetările lui Hannah s-au concentrat pe descoperirea biomarkerilor pentru boala Alzheimer și Parkinson. De asemenea, a lucrat pentru a elucida în continuare căile biologice implicate în aceste boli. În afara muncii sale, Hannah îi place să înoate, să-și ia câinele la plimbare și să călătorească în lume.

Citate