frontiere în Microbiologie

Introducere

familia Astroviridae conține virusuri ARN monocatenare, cu sens pozitiv, fără înveliș, în cadrul a două genuri, Mamastrovirus și Avastrovirus, care infectează mamiferele și, respectiv, păsările. În prezent , Comitetul Internațional pentru taxonomia virusurilor (Comitetul Internațional pentru taxonomia virusurilor, 2018) recunoaște 19 specii, și anume Mamastrovirus-1 până la -19, în cadrul genului Mamastrovirus; cu toate acestea, există numeroase tulpini care așteaptă clasificarea, dintre care unele sunt considerate provizoriu specii noi (Donato și Vijaykrishna, 2017).

din 2010, mai multe astrovirusuri au fost recunoscute din ce în ce mai mult ca neuroinvazive la diferite specii de mamifere, inclusiv la oameni (Quan și colab., 2010; Naccache și colab., 2015), nurca (Blomstr Xtrox și colab., 2010), bovine (Li și colab., 2013), oi (Pfaff și colab., 2017) și porci (Boros și colab., 2017). După recunoașterea inițială a encefalitei asociate cu astrovirus bovin la bovinele din Statele Unite (Li și colab., 2013), un studiu retrospectiv în cazurile de encefalită bovină sporadică de etiologie nedeterminată din Elveția a arătat că acest astrovirus neuroinvaziv a rămas nedetectat de zeci de ani (Selimovic-Hamza și colab., 2016). Deși epidemiologia și căile de transmitere ale acestor astrovirusuri sunt necunoscute, transmiterea între specii a fost sugerată pe baza nivelului ridicat de identitate (>98%), împărțit între astrovirusurile neuroinvazive bovine și ovine la nivelurile de nucleotide și aminoacizi (Boujon și colab., 2017).

Astrovirusuri Bovine (BoAstVs), numite BoAstV-NeuroS1 (Li și colab., 2013) și BoAstV-CH13 (Bouzalas și colab., 2014), au fost găsite inițial în creierul bovinelor cu encefalită non-supurativă în Statele Unite și, respectiv, în Elveția. În ciuda nomenclaturii diferite, ambii viruși reprezintă aceeași specie de genotip (Bouzalas și colab., 2016; Selimovic-Hamza și colab., 2017a) care încă așteaptă clasificarea oficială de către ICTV. În 2015, o tulpină BoAstV necunoscută anterior, numită BoAstV-CH15, a fost identificată în creierul vacilor cu Encefalită din Elveția. Comparația filogenetică completă a genomului a relevat o relație mai strânsă a BoAstV-CH15 cu un astrovirus ovin (OvAstV) decât cu BoAstV-CH13 (seuberlich și colab., 2016). Coinfecția cu BoAstV-CH13 și BoAstV-CH15 a fost, de asemenea, documentată într-un caz (Seuberlich și colab., 2016). În același an în Germania, Schlottau și colab. (2016) a raportat un nou astrovirus, și anume BoAstV-BH89/14, la o vacă cu encefalită, care a fost cel mai strâns legată de OvAstV și BoAstV-CH15. Ulterior, BoAstV-CH13 / NeuroS1 a fost identificat în 2017 în cazurile de encefalită bovină din estul și vestul Canadei (Spinato și colab., 2017; Selimovic-Hamza și colab., 2017b). În 2018, un nou BoAstV neuroinvaziv strâns legat de nord-American și european BoAstV-NeuroS1/BoAstV-CH13, a fost identificat într-un steer cu encefalomielită non-supurativă în Japonia și a fost sugerată apariția recombinării intra-genotipice între tulpinile nord-americane și europene (Hirashima și colab., 2018).

în timp ce cazuri de encefalită asociată astrovirusului au fost raportate în America de Nord, Europa și Asia, prezența lor nu a fost niciodată documentată în emisfera sudică. Aici descriem un caz de encefalită asociată astrovirusului la bovine din Uruguay, care lărgește distribuția geografică și diversitatea genetică a astrovirusurilor neuroinvazive și oferă dovezi filogeografice care sugerează că acest virus a fost introdus în America din Europa și ulterior răspândit în Asia.

materiale și metode

Istorie și semnalizare

în iunie 2018, Un tânăr de 22 de luni Holstein steer într-un grup de 37 de boi într-o fermă de 300 de hectare din Colonia, Uruguay, a dezvoltat cântări neurologice progresive, inclusiv comportament neobișnuit, mers fără scop, circling, ataxie, mișcări repetitive și necoordonate ale limbii și recumbență. Turma a pășunat pe o pășune anuală de ovăz și a fost completată cu siloz de porumb. Un diagnostic clinic prezumtiv de listerioză cerebrală de către medicul veterinar a determinat tratamentul cu penicilină și streptomicină, totuși animalul a murit spontan după un curs clinic care a durat 3 zile.

examinare patologică, hibridizare in situ (ISH) și imunohistochimie (IHC)

capul pilotului a fost scos din carcasă și prezentat la laboratorul de Diagnostic Veterinar al INIA (platforma de sănătate animală) pentru diagnosticare. Jumătate din creier, un segment scurt al măduvei spinării cervicale proximale (C1), ganglionul trigeminal și rădăcina nervului trigeminal, glanda salivară, ganglionul limfatic retrofaringian, orofaringele, esofagul, limba și mușchiul scheletic, au fost fixate prin imersie în formalină tamponată neutră 10% timp de 48-72 ore. țesuturile au fost prelucrate în mod obișnuit pentru histologie, încorporate în parafină, Microtom-secționat la 4-5 unktim și colorat cu hematoxilină și eozină (H&E) și pete Gram.

ish cromogenic a fost efectuat manual pe 5 secțiuni ale trunchiului cerebral, cerebrului și cerebelului fixate cu formalină, încorporate cu parafină (FFPE) pe lamele Superfrost plus (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Statele Unite) folosind trusa de testare roșie Rnascope 2.5 (Cat #322360, Advanced cell Diagnostics, Hayward, CA, Statele Unite) și sonda BoAstV cat. #406921. Sonda este compusă din perechi 20zz care vizează regiunea 5232-6180 a virusului (GenBank KF233994.1). Fiecare secțiune de țesut de 5 centimetri a fost pretratată cu căldură și protează înainte de hibridizarea sondei timp de 2 ore la 40 centimetric C și prelucrată conform recomandărilor producătorilor. Controalele Negative utilizate pentru validarea semnalului au inclus o sondă fără legătură (potrivire cu conținut GC) rulată pe secțiuni seriale și țesut de sondare de la animale neinfectate. Diapozitivele au fost contracarate cu hematoxilină și montate cu EcoMount (Biocare Medical, Concord, CA, Statele Unite).

în plus, IHC a fost efectuat în secțiuni FFPE ale trunchiului cerebral, cerebrului și cerebelului, așa cum s-a descris anterior, pentru identificarea virusului West Nile (WNV, Flavivirus) (Palmieri și colab., 2011), virusul rabiei (Lyssavirus) (Stein și colab., 2010) și Chlamydia spp. (Giannitti și colab., 2016) antigeni.

Virologie moleculară

extracția acidului Nucleic s-a realizat dintr-o probă cumulată de creier congelat (-20 unktc) folosind kitul de izolare a acidului Nucleic Magmax Unktc (Thermo Fisher Scientific). Pentru detectarea astrovirusului, transcripția inversă (RT) a fost efectuată cu Revertaid revers Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) și primeri hexameri aleatori (Qiagen). PCR a fost efectuat de la ADNc folosind MangoMix (Bioline) și primeri care amplifică un fragment 432-nucleotidic al genei polimerazei astrovirus (Tse și colab., 2011). Produsul PCR a fost vizualizat în gel de agaroză 2%, purificat folosind PureLink implant Quick Gel Extraction și Kit combo de purificare PCR (Invitrogen) și secvențiat la Macrogen Inc. (Seul, Coreea De Sud). Pentru amplificarea genomului întreg astrovirus, Maxima h Minus Reverstranscriptaza (Thermo Fisher Scientific)și oligo(dT) 18 pentru obținerea ADNc și MangoMix (Bioline) sau Ranger ADN polimerază (Bioline) cu primeri descriși de Hirashima și colab., 2018, au fost utilizate. Produsele PCR au fost vizualizate în gel de agaroză 1-2%, purificat și secvențiat așa cum s-a menționat mai sus. Asamblarea secvenței a fost efectuată cu SeqMan (Lasergene 8, DNASTAR). Douăzeci și șase de secvențe genomice complete de astrovirus neuroinvaziv de la bovine, ovine, porci, oameni și nurcă și astrovirus enteric bovin Disponibil în GenBank au fost descărcate și aliniate folosind Clustal W în MEGA 7 software (Kumar și colab., 2016). W-IQ-TREE1 (Trifinopoulos și colab., 2016) a fost utilizat pentru a determina modelul cel mai potrivit de evoluție a secvenței (SYM+I+G4) și pentru a construi un arbore filogenetic cu probabilitate maximă cu secvențele aproape complete ale BoAstV detectate în acest caz și acele secvențe complete descărcate de la GenBank, folosind bootstrap ca metodă statistică pentru a evalua robustețea clades. Parcela de similitudine a fost realizată cu software-ul SimPlot (Lole și colab., 1999). Distanțele P la nivelul aminoacizilor ORF2 au fost estimate cu software-ul MEGA 7 (Kumar și colab., 2016).

în plus, a fost efectuată o analiză Filogeografică Bayesiană cu pachetul BEAST v1.8.4 (Drummond și colab., 2012), folosind: Regiunea completă de codificare a liniei BoAstV CH13 / NeuroS1, ORF1ab (gene nestructurale), ORF2 (gene structurale), ORF1a (protează) și o ORF1b parțială (Regiunea genomică polimerază, pentru care au fost disponibile tulpini canadiene), cu toate secvențele disponibile în GenBank (ultima aderare 18 aprilie 2019), pentru a determina rata evolutivă, vârstele/anii strămoșilor comuni și cea mai probabilă cale de circulație virală pe țări (Elveția, Uruguay, Statele Unite, Canada și Japonia). Lipsa recombinării în setul de date a fost determinată utilizând programul de detectare a recombinării 4. Modelul de substituție care se potrivește cel mai bine fiecărei alinieri a fost determinat folosind software-ul MEGA 7 prin valorile Bayesian information criterion (Bic), iar structura temporală a fiecărui set de date a fost evaluată folosind TempEst (Rambaut și colab., 2016). Ceasul molecular relaxat lognormal cu analiza orizontului Bayesian a fost selectat de factorul Bayes printre diferitele combinații de ceasuri moleculare și antecedente de copaci coalescenți utilizate. Țara de detectare a fost folosită ca trăsătură. Lungimea lanțului Markov Monte Carlo a fost de 100 de milioane de generații, asigurând convergența analizei, evaluată în Tracer v1.6.0, iar probabilitatea posterioară a fost utilizată pentru a evalua clade. Arborele maxim de credibilitate clade (MCCT) a fost obținut folosind software-ul TreeAnnotator de la BEAST și vizualizat în FigTree v1.4.3.

în cele din urmă, ADN-ul extras din creierul înghețat a fost procesat prin PCR pentru detectarea herpesvirusurilor bovine 1 și 5 (BHV-1 și -5), așa cum s-a descris anterior (Ashbaugh și colab., 1997).

Bacteriologie

probele proaspete de cerebrum și trunchiul cerebral au fost procesate în mod obișnuit pentru culturi bacteriene aerobe în sânge și Agari MacConkey și cultură selectivă pentru Listeria monocytogenes (Al-Zoreky și Sandine, 1990).

rezultate și discuții

semnele clinice și constatările epidemiologice în cazul descris aici, deși nespecifice, au fost similare cu cele descrise în alte cazuri de encefalită asociată cu astrovirus bovin, care este de obicei descrisă ca sporadică (Selimovic-Hamza și colab., 2016), cu o varietate de deficite neurologice (Deiss și colab., 2017), cu o durată a semnelor clinice care variază de obicei de la 1 zi la 3 săptămâni (Schlottau și colab., 2016; Deiss și colab., 2017; Spinato și colab., 2017; Hirashima și colab., 2018).

examinarea macroscopică a creierului, a segmentului C1 al măduvei spinării și a altor țesuturi ale capului nu a evidențiat leziuni anatomice brute semnificative. Din punct de vedere histologic, a existat meningoencefalomielită moderată până la severă, limfocitară, histiocitară și plasmacitică care afectează telencefalul (inclusiv emisfera cerebrală și hipocampul), trunchiul cerebral și singurul segment examinat al măduvei spinării. Leziunile au fost distribuite predominant în materia cenușie și zonele limitative ale materiei albe. În zonele afectate au existat Manșete perivasculare și inflamații limfoplasmacitice și histiocitare și necroză neuronală/neuronofagie cu glioză în neuropilul adiacent. A existat satellitoză a neuronilor afectați, necrotici (figurile 1A–D). Leziunile au fost mult mai puțin frecvente și severe în parenchimul cerebelos, deși a existat leptomeningită cerebeloasă moderată multifocală. Nu s-au găsit bacterii intralezionale cu pete h&E și Gram. Nu s-au găsit modificări histologice semnificative în celelalte țesuturi examinate.

o infecție virală neuroinvazivă a fost suspectată la examinarea histologică a sistemului nervos central. Bovinele cu encefalită sunt îngrijorătoare, deoarece mulți neuropatogeni ai rumegătoarelor sunt zoonotici (Cantile și Youssef, 2016); astfel, un diagnostic de encefalită ar trebui să solicite teste de laborator extinse pentru a examina agenții infecțioși atunci când este posibil. În cazul descris aici, IHC pentru WNV, virusul rabiei și Chlamydia spp., și PCR pentru BHV-1 și -5 au fost toate negative și nu au fost cultivate bacterii patogene din țesutul cerebral. Deoarece boul avea vârsta < 2 ani și nu s-au observat modificări spongiforme la nivelul trunchiului cerebral, animalul nu a fost testat pentru encefalopatia spongiformă bovină (ESB), care este o boală exotică a bovinelor adulte care nu a fost raportată niciodată în Uruguay. Mai mult, ESB nu este inflamator (Cantile și Youssef, 2016).

hibridizarea in situ a fost efectuată folosind o sondă generată de BoAstV-NeuroS1 și a existat o hibridizare a sondei abundentă în interior și limitată la citoplasma neuronilor din emisfera cerebrală și hipocampus (figurile 1E–G). În aceste zone hibridizarea sondei colocalizată cu neuroni necrotici și regiuni de glioză, fără hibridizare sondă detectabilă în celulele gliale sau celulele inflamatorii ale manșetelor perivasculare. Nu a fost detectat acid nucleic viral de ISH în cerebel, care a avut doar leziuni inflamatorii minime în parenchim, dar leptomeningită moderată sau trunchiul cerebral, inclusiv secțiuni cu inflamație severă. Aceasta înseamnă că, topografic, detectarea distribuției virale de către ISH a fost mai limitată decât encefalita în secțiunile examinate, care a fost descrisă ocazional în cazurile de encefalită asociată cu BoAstV-CH13/NeuroS1 la bovine (Selimovic-Hamza și colab., 2017a, b). Un motiv pentru această lipsă ocazională de detectare a ARN-ului viral în zonele lezate ale creierului ar putea fi limita de detectare a ISH sau eliminarea virusului în zonele inflamate ale creierului până la momentul morții, așa cum s-a sugerat anterior (Selimovic-Hamza și colab., 2017b). Așa cum era de așteptat, nici o hibridizare a sondei nu a fost detectată de ISH în țesutul cerebral utilizat ca control negativ.

Astrovirus a fost detectat în creier prin RT-PCR. Analiza aproape completă a secvenței genomului a relevat o tulpină de Mamastrovirus în cadrul cladei CH13/NeuroS1, pe care am numit-o BoAstV-Neuro-Uy, secvența a fost depusă în GenBank sub numărul de aderare MK386569. Analiza filogenetică a relevat proximitatea cu alte astrovirusuri neuroinvazive din clada Virginia/Human-Mink-Ovine (va / HMO) (Figura 2), care conține cele mai cunoscute astrovirusuri neuroinvazive (Hirashima și colab., 2018; Reuter și colab., 2018). Secvența aproape completă a BoAstV-Neuro-Uy are o lungime de 6427 bp și are o identitate de secvență de 94% cu tulpina KagoshimaSR28-462. BoAstV-Neuro-Uy are caracteristici similare cu alte tulpini de descendență CH13 / NeuroS1: o regiune 5 ‘ UTR de 51 nt, ORF1a (protează) de 861 aminoacizi (aa), ORF1b de 523 aa (ARN-polimerază dependentă de ARN) și ORF2 de 758 aa (proteină capsidă). Din păcate, 3 ‘ UTR nu a putut fi secvențiat, dar se presupune că este prezentă o coadă Poli(a), deoarece oligo(dT)18 a fost folosit pentru a obține ADNc. În plus, este prezentă secvența aaaaaac heptamerică, un semnal ribozomal de schimbare a cadrelor. Distanțele P la nivelul aminoacizilor ORF2 au confirmat atribuirea acestei tulpini la clada CH13 / NeuroS1. P-distanțe < 0.35 între BoAstV-Neuro-Uy și alți membri ai acestei clade (Tabelul 1) ar susține o clasificare a acestor tulpini virale în cadrul aceleiași specii; Mamastrovirus-13 a fost recent propus de alți autori (Donato și Vijaykrishna, 2017; Hirashima și colab., 2018), deși atribuirea anumitor specii de către ICTV este în așteptare. Sonda utilizată pentru ISH, generată de BoAstV-NeuroS1, avea 92,7% identitate de secvență cu BoAstV-Neuro-Uy.

studiile bazate pe examinări neuropatologice și detectarea acidului nucleic și a proteinelor astrovirus au concluzionat că există o relație cauzală probabilă între infecția cu astrovirus și boala neurologică și leziunile la bovine (Selimovic-Hamza și colab., 2017a; Reuter și colab., 2018). Din câte știm, encefalita asociată cu astrovirus nu a fost încă reprodusă experimental. Acest lucru ar necesita izolarea astrovirusurilor neuroinvazive din cazurile clinice, ceea ce nu a fost încercat în cazul nostru.

sursa BoAstV-Neuro-Uy în acest caz nu a putut fi determinată. Cu toate acestea, ar trebui luate în considerare bovinele de rezervor și fauna sălbatică, deoarece vitele au fost crescute în condiții extinse în aer liber. Animalul afectat a fost cumpărat și mutat la fermă în februarie 2018 împreună cu alți 9 boi. Din păcate, proprietarul a refuzat prelevarea și testarea suplimentară a altor animale din proprietate și o investigație epidemiologică mai detaliată. Niciunul dintre celelalte animale din grup nu a dezvoltat boli neurologice începând cu August 2018, ultima dată când medicul veterinar a fost contactat. O sezonalitate de la începutul iernii până la sfârșitul primăverii a fost sugerată pentru cazurile de encefalită asociată cu astrovirus în Elveția (Selimovic-Hamza și colab., 2016). Interesant este că cazul descris aici a avut loc în iunie, corespunzând perioadei de tranziție toamnă-iarnă din emisfera sudică.

în timp ce astrovirusurile neurotrope au fost identificate în America de Nord (Li și colab., 2013; Spinato și colab., 2017), Europa (Bouzalas și colab., 2014) și Asia (Hirashima și colab., 2018), prezența lor nu a fost niciodată raportată în emisfera sudică, astfel încât această comunicare lărgește distribuția geografică a encefalitei asociate astrovirusului. Pentru a evalua dacă tulpina virală detectată în Uruguay ar fi putut proveni din Europa, America de nord sau Asia, am estimat rata evolutivă și am efectuat o analiză filogeografică folosind secvențe de lăudăros neuroinvazive disponibile în GenBank. Rata evolutivă estimată folosind regiunea de codificare completă a fost 4.27 int 10-4 (95% cea mai mare densitate de probabilitate-HPD-, 2,19–6,46 int 10-4) substituții nucleotidice/situs/an, care este de așteptat pentru un virus ARN (Jenkins și colab., 2002), dar mai mică decât cea estimată pentru astrovirusurile umane enterice (Babkin și colab., 2012, 2014). La ORF1ab regiune a arătat un anunț similar evoluției ratei (4.20 × 10-4, 95% HPD 1.66–6.46 × 10-4 substituții/site/an), ca de codificare completă regiune, în timp ce ORF1a (2.92 × 10-4, 95% HPD 1.19 × 10-6-6.46 × 10-4 substituții/site/an) și ORF2 (2.86 × 10-4, 95% HPD 4.13 × 10-6-5.79 substituții 10-4/sit/an) au prezentat o rată evolutivă ușor mai rapidă, iar regiunea genomică parțială a polimerazei (ORF1b) a prezentat o rată evolutivă ușor mai lentă (5.39 10-4, 95% HPD 6.41 10-7-1, 10 10-3 substituții/sit/an).

conform analizei filogeografice cu regiunea de codificare completă și prezentată în MCTT (Figura 3), Există două sub-linii (CH13 și NeuroS1) bazate pe tulpini de referință, care au un strămoș comun. Cel mai recent strămoș comun al acestor sub-linii (linia CH13/NeuroS1) a apărut în Europa aproximativ în 1885 (95% HPD, 1794-1940). La începutul anilor 1900, cele două sub-linii au divergut, sub-linia CH13 a rămas în circulație în Europa, în timp ce sub-linia NeuroS1 s-a răspândit în America și Asia. Cel mai probabil scenariu este că sub-descendența NeuroS1 a fost introdusă în Uruguay din Europa în jurul anului 1921 (95% HPD, 1849-1967), probabil prin comerțul cu animale, apoi s-a răspândit în America de Nord și mai târziu în Japonia (Figura 3). Datorită limitării numărului de secvențe disponibile în GenBank, care ar fi putut influența analiza, rezultatele obținute utilizând regiunea de codificare completă au fost comparate cu cele obținute cu alte regiuni genomice (ORF1ab, ORF2, ORF1a și ORF1b) disponibile pentru un număr mai mare de tulpini (adică tulpini canadiene). În toate analizele, scenariul cel mai probabil este că introducerea virusului în Uruguay a avut loc din Europa (cifrele suplimentare S1A–D). În plus, data estimată pentru această introducere, obținută cu ORF1ab și regiunea genomică parțială a polimerazei (ORF1b) (figurile suplimentare S1A,D), a fost similară cu cea obținută cu regiunea de codificare completă, în timp ce data estimată a introducerii obținută cu ORF2 și ORF1a a fost anterioară,dar cu un interval HPD mai mare de 95% (figurile suplimentare S1B, C). O introducere A sub-liniei NeuroS1 direct în Canada din Europa, cu răspândirea ulterioară în Statele Unite și Japonia, este, de asemenea, plauzibilă, s prezentată în figura suplimentară S1D.

sunt necesare investigații suplimentare pentru a evalua distribuția geografică, mecanismele patogene (în special mecanismele de transmitere și intrare), epidemiologia moleculară și transmiterea potențială interspecifică a astrovirusurilor neuroinvazive.

disponibilitatea datelor

seturile de date generate pentru acest studiu pot fi găsite în GenBank, MK386569.

contribuțiile autorului

FG, RDC și MC au contribuit la concepția studiului. FG și RDC au efectuat examinarea patologică și eșantionarea. PP a efectuat hibridizarea in situ. FU a efectuat imunohistochimia. LM, RC și MC au efectuat teste de virologie moleculară. MC a efectuat secvența și analizele filogeografice și cifrele asociate. FG și PP au obținut imaginile histologice. MF a efectuat culturile bacteriene. FG și MC au scris prima schiță a manuscrisului. RDC, PP, FU, LM, MF și RC au scris secțiuni ale manuscrisului. Toți autorii au contribuit la revizuirea manuscrisului, au citit și au aprobat versiunea trimisă.

finanțare

această lucrare a fost finanțată prin Granturile PL-015 N-15156 de la INIA și 158 de la „Programul de Iniciaci a la Investigaci a la Investigaci 2017 „de la” comisii a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută a la sută. MC și CRD recunosc sprijinul” Agenției Naționale pentru cercetare și inovare ” (ani) și, respectiv, INIA, prin burse de doctorat. FG recunoaște sprijinul ani prin grant de mobilitate MOV_CA_2018_1_150021.

Declarație privind conflictul de interese

autorii declară că cercetarea a fost realizată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.

recenzorul TS a declarat un trecut co-autor cu unul dintre autorii PP editorului de manipulare.

mulțumiri

autorii mulțumesc Yisell Perdomo și Cecilia Monesiglio de la INIA, și Karen Sverlow și Juliann Beingesser de la cahfs pentru asistență tehnică.

material suplimentar

materialul suplimentar pentru acest articol poate fi găsit online la: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.01240/full#supplementary-material

figura S1 / arborii de credibilitate maximă a cladei (Mcct) obținuți prin analiza ORF1ab (a), ORF2 (B), ORF1a (C) și orf1b (D) parțiale. Culoarea ramurilor reprezintă țara cea mai probabilă în care au circulat strămoșii, valorile probabilității posterioare sunt afișate în ramuri, iar numerele din fiecare nod reprezintă anii de origine pentru fiecare cladă cu intervalul HPD de 95%. Sub-liniile sunt indicate cu etichete.

note de subsol

1. ^http://iqtree.cibiv.univie.ac.at