Proteinaza K
activată de calciu, enzima digeră proteinele preferențial după aminoacizii hidrofobi (aminoacizi alifatici, aromatici și alți hidrofobi). Deși ionii de calciu nu afectează activitatea enzimei, ei contribuie la stabilitatea acesteia.Proteinele vor fi digerate complet dacă timpul de incubație este lung și concentrația de protează suficient de mare. La îndepărtarea ionilor de calciu, stabilitatea enzimei este redusă, dar activitatea proteolitică rămâne. Proteinaza K are două situsuri de legare pentru Ca2+, care sunt situate aproape de centrul activ, dar nu sunt implicate direct în mecanismul catalitic. Activitatea reziduală este suficientă pentru digerarea proteinelor, care de obicei contaminează preparatele de acid nucleic. Prin urmare, digestia cu Proteinaza K pentru purificarea acizilor nucleici se efectuează de obicei în prezența EDTA (inhibarea enzimelor dependente de ioni metalici, cum ar fi nucleazele).
Proteinaza K este, de asemenea, stabilă pe o gamă largă de pH (4-12), cu un pH optim de pH 8,0.O creștere a temperaturii de reacție de la 37 C la 50-60 C poate crește activitatea de mai multe ori, cum ar fi adăugarea de 0,5–1% dodecil sulfat de sodiu (SDS) sau clorură de Guanidiniu (3 M), tiocianat de Guanidiniu (1 m) și uree (4 m). Condițiile menționate mai sus sporesc activitatea proteinazei K, făcând Site-urile sale de scindare a substratului mai accesibile. Temperaturile peste 65 C, acidul tricloracetic (TCA) sau inhibitorii de serină protează aebsf, PMSF sau DFP inhibă activitatea. Proteinaza K nu va fi inhibată de clorura de Guanidiniu, tiocianat de Guanidiniu, uree, Sarkosil, Triton X-100, Tween 20, SDS, citrat, acid iodoacetic, EDTA sau de alți inhibitori de serin-protează, cum ar fi Na-Tosil-Lys Clorometil cetonă (TLCK) și Na-Tosil-Phe Clorometil cetonă (TPCK).
activitatea proteazei K în tampoanele utilizate în mod obișnuit
| tampon (pH = 8,0, 50 ct, 1,25 ct/mL protează K, 15 min incubare) | activitate proteinază K (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris * Cl | 100 |
| 30 mM Tris * Cl; 30 mm EDTA; 5% între 20; 0,5% Triton X-100; 800 mm GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris * Cl; 36 mm EDTA; 5% între 20; 0,36% Triton X-100; 735 mm GuHCl | 301 |
| 10 mM Tris * Cl; 25 mm EDTA; 100 mm Naci; 0,5% SDS | 128 |
| 10 mM Tris * Cl; 100 mm EDTA; 20 mM Naci; 1% Sarkosil | 74 |
| 10 mM Tris * Cl; 50 mm KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,45% între 20; 0,5% Triton X-100 | 106 |
| 10 mM Tris * Cl; 100 mm EDTA; 0.5% FDS | 120 |
| 30 Mm Tris * Cl; 10 mm EDTA; 1% FDS | 203 |