Purificarea proteinelor
alegerea unui material de pornire este esențială pentru proiectarea unui proces de purificare. Într-o plantă sau animal, o anumită proteină de obicei nu este distribuită omogen în tot corpul; diferite organe sau țesuturi au concentrații mai mari sau mai mici ale proteinei. Utilizarea numai a țesuturilor sau organelor cu cea mai mare concentrație scade volumele necesare pentru a produce o anumită cantitate de proteine purificate. Dacă proteina este prezentă în abundență scăzută sau dacă are o valoare ridicată, oamenii de știință pot folosi tehnologia ADN recombinant pentru a dezvolta celule care vor produce cantități mari de proteină dorită (acest lucru este cunoscut sub numele de sistem de Expresie). Expresia recombinantă permite etichetarea proteinei, de exemplu printr-un His-tag sau Strep-tag pentru a facilita purificarea, reducând numărul de etape de purificare necesare.
o purificare analitică utilizează în general trei proprietăți pentru a separa proteinele. În primul rând, proteinele pot fi purificate în funcție de punctele lor izoelectrice prin trecerea lor printr-un gel gradat de pH sau o coloană de schimb ionic. În al doilea rând, proteinele pot fi separate în funcție de mărimea sau greutatea lor moleculară prin cromatografie de excludere a mărimii sau prin analiza SDS-PAGE (electroforeză în gel dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă). Proteinele sunt adesea purificate prin utilizarea paginii 2D și sunt apoi analizate prin amprentarea masei peptidice pentru a stabili identitatea proteinei. Acest lucru este foarte util în scopuri științifice, iar limitele de detectare a proteinelor sunt în prezent foarte scăzute, iar cantitățile de nanograme de proteine sunt suficiente pentru analiza lor. În al treilea rând, proteinele pot fi separate prin polaritate/hidrofobicitate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță sau cromatografie în fază inversă.
de obicei, un protocol de purificare a proteinelor conține unul sau mai mulți pași cromatografici. Procedura de bază în cromatografie este de a curge soluția care conține proteina printr-o coloană ambalată cu diverse materiale. Diferite proteine interacționează diferit cu materialul coloanei și pot fi astfel separate de timpul necesar pentru a trece coloana sau de condițiile necesare pentru a Eluta proteina din coloană. De obicei, proteinele sunt detectate pe măsură ce ies din coloană prin absorbanța lor la 280 nm. Există multe metode cromatografice diferite:
cromatografia de excludere a mărimii
cromatografia poate fi utilizată pentru a separa proteinele în soluție sau condiții de denaturare prin utilizarea gelurilor poroase. Această tehnică este cunoscută sub numele de cromatografie de excludere a mărimii. Principiul este că moleculele mai mici trebuie să traverseze un volum mai mare într-o matrice poroasă. În consecință, proteinele cu o anumită dimensiune vor necesita un volum variabil de eluent (solvent) înainte de a fi colectate la celălalt capăt al coloanei de gel.
în contextul purificării proteinelor, eluentul este de obicei grupat în eprubete diferite. Toate eprubetele care nu conțin urme măsurabile de proteină de purificat sunt aruncate. Soluția rămasă este astfel făcută din proteine pentru a purifica și orice alte proteine de dimensiuni similare.
separarea pe baza sarcinii sau hidrofobieedit
cromatografie de interacțiune Hidrofobăedit
mediile HIC sunt amfifile, cu regiuni hidrofobe și hidrofile, permițând separarea proteinelor pe baza hidrofobiei lor de suprafață. Proteinele țintă și speciile lor agregate de produse tind să aibă proprietăți hidrofobe diferite și îndepărtarea lor prin HIC purifică în continuare proteina de interes. În plus, mediul utilizat folosește de obicei condiții de denaturare mai puțin dure decât alte tehnici de cromatografie, contribuind astfel la păstrarea proteinei de interes în starea sa nativă și funcțională. În apa pură, interacțiunile dintre rășină și regiunile hidrofobe ale proteinei ar fi foarte slabe, dar această interacțiune este îmbunătățită prin aplicarea unei probe de proteine la rășina HIC în tampon cu rezistență Ionică ridicată. Rezistența ionică a tamponului este apoi redusă pentru a Eluta proteinele în ordinea descrescătoare a hidrofobicității.
cromatografie cu schimb de ioni
cromatografia cu schimb de ioni separă compușii în funcție de natura și gradul sarcinii lor ionice. Coloana care urmează să fie utilizată este selectată în funcție de tipul și puterea de încărcare. Rășinile schimbătoare de anioni au o sarcină pozitivă și sunt utilizate pentru a reține și separa compușii încărcați negativ (anioni), în timp ce rășinile schimbătoare de cationi au o sarcină negativă și sunt utilizate pentru a separa moleculele încărcate pozitiv (cationi).
înainte de începerea separării, un tampon este pompat prin coloană pentru a echilibra ionii încărcați opuși. La injectarea probei, moleculele de solut se vor schimba cu ionii tampon pe măsură ce fiecare concurează pentru locurile de legare de pe rășină. Durata de retenție pentru fiecare solut depinde de puterea încărcăturii sale. Compușii cei mai slab încărcați vor Eluta mai întâi, urmați de cei cu sarcini succesiv mai puternice. Datorită naturii mecanismului de separare, pH-ul, Tipul tampon, concentrația tamponului și temperatura joacă toate roluri importante în controlul separării.
cromatografia cu schimb de ioni este un instrument foarte puternic pentru utilizarea în purificarea proteinelor și este frecvent utilizată atât în separările analitice, cât și în cele preparative.
electroforeză cu flux Liberedit
electroforeza cu flux liber (FFE) este o tehnică de electroforeză fără purtător care permite separarea proteinelor preparative într-un flux tampon laminar prin utilizarea unui câmp electric ortogonal. Folosind un gradient de pH, care poate fi indus, de exemplu, de amfoliți, această tehnică permite separarea izoformelor proteice până la o rezoluție de < 0,02 delta-pI.
cromatografie de Afinitateedit
cromatografia de afinitate este o tehnică de separare bazată pe Conformație moleculară, care utilizează frecvent rășini specifice aplicației. Aceste rășini au liganzi atașați la suprafețele lor, care sunt specifici pentru compușii care trebuie separați. Cel mai frecvent, acești liganzi funcționează într-un mod similar cu cel al interacțiunilor anticorp-antigen. Această potrivire „blocare și cheie” între ligand și compusul său țintă îl face foarte specific, generând frecvent un singur vârf, în timp ce toate celelalte din eșantion nu sunt păstrate.
multe proteine membranare sunt glicoproteine și pot fi purificate prin cromatografia afinității lectinei. Proteinele solubilizate în Detergent pot fi lăsate să se lege de o rășină cromatografică care a fost modificată pentru a avea o lectină atașată covalent. Proteinele care nu se leagă de lectină sunt spălate și apoi glicoproteinele legate în mod specific pot fi eluate prin adăugarea unei concentrații ridicate de zahăr care concurează cu glicoproteinele legate la locul de legare a lectinei. Unele lectine au o afinitate ridicată de legare la oligozaharidele glicoproteinelor, care este greu de concurat cu zaharurile, iar glicoproteinele legate trebuie eliberate prin denaturarea lectinei.
cromatografia Imunoafinitățiimodificare
cromatografia Imunoafinității utilizează legarea specifică a unui anticorp-antigen pentru a purifica selectiv proteina țintă. Procedura implică imobilizarea unei proteine pe un substrat solid (de exemplu, o perlă poroasă sau o membrană), care apoi leagă selectiv ținta, în timp ce orice altceva curge. Proteina țintă poate fi eluată prin modificarea pH-ului sau a salinității. Ligandul imobilizat poate fi un anticorp (cum ar fi imunoglobulina G) sau poate fi o proteină (cum ar fi proteina a). Deoarece această metodă nu implică inginerie într-o etichetă, ea poate fi utilizată pentru proteine din surse naturale.
purificarea unei proteine etichetate
o altă modalitate de a eticheta proteinele este de a proiecta o etichetă peptidică antigen pe proteină și apoi de a purifica proteina pe o coloană sau prin incubarea cu o rășină Liberă Care este acoperită cu un anticorp imobilizat. Această procedură specială este cunoscută sub numele de imunoprecipitare. Imunoprecipitarea este destul de capabilă să genereze o interacțiune extrem de specifică, care de obicei are ca rezultat legarea numai a proteinei dorite. Proteinele etichetate purificate pot fi apoi ușor separate de celelalte proteine în soluție și ulterior eluate înapoi în soluție curată.
când etichetele nu mai sunt necesare, ele pot fi scindate de o protează. Aceasta implică adesea ingineria unui situs de clivaj al proteazei între etichetă și proteină.
HPLCEdit
cromatografie lichidă de înaltă performanță sau cromatografie lichidă de înaltă presiune este o formă de cromatografie care aplică presiune ridicată pentru a conduce substanțele dizolvate prin coloană mai repede. Aceasta înseamnă că difuzia este limitată și rezoluția este îmbunătățită. Cea mai comună formă este „faza inversată” HPLC, unde materialul coloanei este hidrofob. Proteinele sunt eluate printr-un gradient de cantități crescânde de solvent organic, cum ar fi acetonitrilul. Proteinele se eluează în funcție de hidrofobicitatea lor. După purificarea prin HPLC, proteina se află într-o soluție care conține numai compuși volatili și poate fi ușor liofilizată. Purificarea HPLC duce frecvent la denaturarea proteinelor purificate și, prin urmare, nu se aplică proteinelor care nu se reumple spontan.