stabilirea unui test de legare competitiv care identifică diferitele caracteristici ale Epitopilor neutralizanți ai virusului hepatitei E

rezumat

are ca scop: confirmarea diferitelor caracteristici ale epitopilor neutralizanți specifici genotipului și comuni ai virusului hepatitei E (HEV). Metode: A fost stabilit un test competitiv de legare cu anticorpi monoclonali neutralizanți comuni (mab) 3G1 și 5G5 cunoscuți ca genotip, precum și mAbs 2B1 și 4C5 neutralizanți specifici genotipului. HEV ORF2 recombinant p166w01 derivat din genotipul 1 și p166Chn derivat din genotipul 4 au fost utilizate ca antigene acoperite, pentru a determina dacă mab recunosc epitopi independenți, similari sau care se suprapun. mab-urile au fost produse, purificate și conjugate cu peroxidază de hrean (HRP). 2B1 conjugat cu HRP ar putea reacționa numai cu p166W01, dar nu cu p166Chn, 4C5 conjugat cu HRP ar putea reacționa numai cu p166Chn, dar nu cu p166W01, în timp ce 3G1 și 5G5 conjugate cu HRP ar putea reacționa atât cu p166W01, cât și cu p166Chn. Astfel, testele de legare competitive au fost efectuate succesiv folosind antigenul p166W01 și p166chn. Rezultate și concluzie: rezultatele testelor de legare competitive au arătat că legarea 2B1 conjugată cu HRP la p166W01 nu a putut fi inhibată de 5G5 sau 3G1. În mod similar, legarea 4C5 conjugată cu HRP la p166Chn nu a putut fi inhibată de 5G5 sau 3G1. Cu toate acestea, mab-urile 5G5 și 3G1 s-au blocat reciproc legarea la p166W01 și p166Chn, sugerând că mab-urile neutralizante comune și specifice genotipului recunosc epitopi independenți.

2018 S. Karger AG, Basel

Introducere

virusul hepatitei E (HEV) este un virus ARN cu catenă pozitivă, care se transmite în principal pe cale orală și provoacă hepatita E acută umană . Infecția cu HEV poate duce la prognostici dăunători, de exemplu insuficiență de viață, hepatită acută severă, infecție cronică la organul transplantat și la pacienții imunosupresați și mortalitate ridicată la femeile gravide . În plus față de infecția confirmată la om, HEV infectează și animalele și pot fi transmise de la animale la ființe umane; incidența infecției cu hepatita E în țările dezvoltate a crescut, de asemenea, semnificativ . Aceste constatări indică faptul că HEV reprezintă o amenințare pentru sănătatea publică pe tot globul .

deși un serotip a fost recunoscut, izolatele HEV, derivate din diferite zone din întreaga lume, ar putea fi clasificate în 4 genotipuri majore . Hev-urile genotipurilor 1 și 2 diferă de genotipurile 3 și 4 prin caracteristicile lor epidemiologice, antigenice și imunogene .

până în prezent, cercetările privind caracterizarea epitopilor antigenici bazate în principal pe proteina structurală HEV pentru un sistem de cultură in vitro nu sunt disponibile . pORF2 este proteina structurală majoră HEV codificată de ORF2, care este 1 din 3 cadre de citire deschise suprapuse (ORFs) ale genomului viral . Regiunile imunogene predominante ale pORF2 au fost localizate în regiunea C-terminal 2/3, care au fost principalele ținte ale dezvoltării vaccinului .

studiul nostru anterior a relevat existența unei diferențe de imunogenitate între vaccinul hepatitic e p179 (439-617 aminoacizi ai proteinei ORF2) derivat din genotipul 4 și p239 (Hecolin) derivat din genotipul 1, Diferența putând fi atribuită prezenței epitopului(epitopilor) specific genotipului HEV . Anticorpii monoclonali (mab) produși la șoareci imunizați respectiv cu p166Sar(452-617 aminoacizi ai proteinei ORF2) derivați din genotipul 1 și p166Chn derivați din genotipul 4 au fost utilizați pentru a confirma prezența epitopului (epitopilor) GE notype-specific. Pe lângă 2 mab-uri neutralizante comune de genotip, 3G1 și 5G5, au fost obținute și 2 mab-uri neutralizante specifice genotipului, 2B1 și 4C5. 2B1 împotriva p166Sar s-ar putea lega în mod specific de genotipurile 1 și 2 proteine recombinante și au neutralizat numai genotipurile 1 și 2 tulpini in vitro; 4C5 împotriva p166chn imunoreacționat specific împotriva genotipurilor 3 și 4 proteine recombinante și neutralizate numai genotipul 3 și 4 tulpini, în timp ce 3G1 împotriva p166Sar și 5G5 împotriva p166Chn s-ar putea lega de genotipurile 1-4 proteine recombinante și neutralizate 4 tulpini genotipice . Pentru studierea ulterioară a diferitelor caracteristici ale epitopilor neutralizanți genotipici obișnuiți și specifici genotipului HEV, a fost dezvoltat un test de legare competitiv folosind mAbs 2b1, 3G1, 4C5 și 5G5, pentru a confirma dacă epitopii recunoscuți de mab sunt independenți, similari sau suprapuneri.

materiale și metode

proteine recombinante

P166 Recombinant a fost o proteină trunchiată a pORF2, secvențele de nucleotide au fost derivate din următoarele tulpini HEV: W01 (genotipul 1, JX857689) și China-9829 (genotipul 4, AY789225). Plasmidele recombinante au fost construite și exprimate în Escherichia coli . Cele 2 proteine p166 etichetate cu His au fost desemnate ca p166W01 și, respectiv, p166Chn.

producția de mAb

un total de 4 mab-uri neutralizante, 2B1, 3G1, 4C5 și 5G5 descrise anterior, au fost utilizate pentru a dezvolta un test imunosorbent competitiv legat de enzime (ELISA). 2B1 și 3G1 au fost ridicate împotriva p166Sar; 4C5 și 5G5 au fost ridicate împotriva p166Chn . Mab – urile au fost produse prin injectarea a 106 celule hybridoma în cavitatea peritoneală a unui șoarece BALB/c; lichidul de ascită care conține mab-uri a fost recoltat după 7-10 zile, filtrat, centrifugat și depozitat la -80 C .

purificarea mab

lichidul de ascită mAb a fost purificat folosind cromatografia de afinitate a coloanei de proteină g-sepharoză (Sigma, Germania). Fracțiile care conțin anticorpi au fost colectate folosind tamponul de eluție acidă (0,1 m glicină-HCl, pH 2,8) din proteina G imobilizată și apoi determinate la 280 nm; absorbanța la 280 nm (A280) poate fi utilizată pentru a cuantifica aproximativ mab-urile. Electroforeza în gel de poliacrilamidă sulfat de sodiu a fost utilizată pentru confirmarea și cuantificarea fracțiilor purificate utilizând albumina serică bovină .

cuplarea peroxidazei de hrean cu MAB

mab-urile purificate au fost dializate împotriva tamponului carbonat/bicarbonat de 100 mM (pH 9,3) la 4 centimetrii C peste noapte . Anticorpii au fost cuplați la peroxidază de hrean (HRP) prin instrucțiunile producătorului (KPL). Aproximativ 1,5 mg de HRP au fost amestecate cu 0,5 mg de mAb în 0,5 mL volum total de tampon de conjugare HRP, prin agitare ușoară la temperatura camerei timp de 1 oră. amestecul a fost lăsat la temperatura camerei timp de 15 minute după ce s-au adăugat 10 unktil de agent reducător și apoi s-a adăugat 1 volum de glicerol distilat pentru depozitare și utilizare ulterioară.

reactivitatea încrucișată a mab-urilor conjugate cu HRP la antigenul P166 heterolog

metoda ELISA a fost aplicată pentru a confirma reactivitatea încrucișată a mab-urilor conjugate cu HRP cu antigenul p166W01 și p166chn . Pe scurt, puțurile de microplăci au fost acoperite cu 100 ng de antigen p166W01 și, respectiv, p166chn, incubate timp de 2 ore la 37 centimetric C. Aceasta a fost urmată de îndepărtarea antigenelor acoperite; 200 centimetric de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) conținând 0,1% albumină serică bovină au fost adăugate în puțuri și apoi microplăcile au fost incubate la temperatura camerei cu agitare ușoară. Două ore mai târziu, tamponul de blocare a fost aruncat, iar puțurile au fost spălate de două ori cu PBS conținând 0,05% Tween-20 (PBST). S-au adăugat diluții seriale de 2 ori ale mab-urilor conjugate HRP cuprinse între 1: 400 și 1: 25.600 în PB-uri de cazeină 1% în godeurile corespunzătoare, urmate de 45 min de incubație la 37 CTC; cazeina PBS a fost îndepărtată prin spălare de 5 ori cu PBST. Substratul lichid de tetrametilbenzidină a fost adăugat pentru dezvoltarea culorii pentru incubare la 37 centimetric C timp de 10 min. În cele din urmă, densitatea optică (OD) a fiecărui Puț a fost citită la 450 nm, cu o lungime de undă de referință de 630 nm.

determinarea titrurilor antigenului și mAb

titrurile antigenului și mab au fost determinate utilizând un ELISA. Inițial, s-au preparat diluții seriale de 2 ori ale mab-urilor conjugate HRP cuprinse între 1: 400 și 1: 25.600 în PBS de cazeină 1%, apoi s-au adăugat în godeuri preacoperite cu diluții seriale de antigen p166W01 sau p166chn. Urmată de o incubare de 45 de minute la 37 C, mab-urile nelegate au fost îndepărtate prin spălare de 5 ori cu PBST. Substratul lichid de tetrametilbenzidină a fost adăugat pentru dezvoltarea culorii pentru o incubare de 10 minute la 37 C. În cele din urmă, OD-ul fiecărui godeu a fost citit la 450 nm, cu o lungime de undă de referință de 630 nm, pentru a determina diluția care a fost subsaturantă și a dat o citire OD de aproximativ 1,0 la 450 nm, cu o lungime de undă de referință de 630 nm.

test competitiv de legare

diferitele caracteristici ale epitopilor neutralizanți comuni și specifici genotipului HEV au fost investigate utilizând un test competitiv de legare în perechi stabilit cu MAB neutralizanți comuni și specifici genotipului . Metodele au fost similare cu procedurile descrise mai sus, cu excepția faptului că p166W01 și p166Chn au fost utilizate ca antigen de acoperire, respectiv, și amestecuri de MAB conjugat cu HRP la o concentrație dublă și o concentrație saturată de MAB neconjugat au fost adăugate în godeurile acoperite. OD a fost măsurată la 450 nm, cu o lungime de undă de referință de 630 nm. Procentul de inhibare a fost calculat folosind formula: 100 centic . Concurența a fost evaluată ca pozitivă dacă procentul de inhibare a fost mai mare de 50%.

rezultate

reactivitatea încrucișată a mab-urilor conjugate cu HRP la antigenul P166 heterolog

metoda ELISA a fost aplicată pentru a evalua reactivitatea încrucișată a mab-urilor conjugate cu HRP la antigenele p166W01 și p166Chn. Rezultatele au arătat că 2B1 conjugat cu HRP la diluții de la 1: 400 la 1: 25.600 a reacționat doar cu p166W01, dar nu cu p166Chn, iar 4C5 conjugat cu HRP la diluții de la 1: 400 la 1: 25.600 a reacționat doar cu p166Chn. În schimb, 3G1 și 5G5 conjugate cu HRP la diluții de la 1: 400 la 1: 25.600 au reacționat bine cu cele 2 proteine p166 (Fig. 1). Aceste observații au fost similare cu constatările anterioare, 2b1 și 4C5 sunt mab-uri specifice genotipului, în timp ce 3G1 și 5G5 sunt mab-uri comune genotipului .

determinarea antigenului p166W01 și a titrurilor MAB conjugate cu HRP pentru testul competitiv de legare

antigenul p166W01 a fost utilizată pentru a stabili testul competitiv de legare a mab 2B1, 3G1 și 5G5; titrurile corespunzătoare ale mab și antigenului au fost determinate folosind ELISA. După cum se arată în tabelul 1, după titrarea pătrată, când diluția antigenului p166W01 a fost de 1: 400, 2B1 conjugat cu HRP a fost de 1: 6400, valoarea medie a OD a fost apropiată de 1,0. Între timp, așa cum se arată în tabelul 2, Când diluția antigenului a fost 1: 400, 5G5 conjugat cu HRP și 3G1 conjugat cu HRP au fost 1: 6.400 și, respectiv, 1: 12.800, iar valoarea medie a OD a fost apropiată de 1,0.

determinarea antigenului p166Chn și a titrurilor MAB conjugate cu HRP pentru testul competitiv de legare

antigenul p166Chn a fost utilizat pentru a stabili testul competitiv de legare a mab 4C5, 3G1 și 5G5, titrurile corespunzătoare ale mab și antigenului au fost, de asemenea, determinate folosind ELISA. După cum se arată în tabelul 3, după titrarea pătrată, când diluția antigenului p166Chn a fost de 1: 800, 4C5 conjugat cu HRP a fost de 1: 6400, iar valoarea medie a OD a fost apropiată de 1,0. Între timp, așa cum se arată în tabelul 4, Când diluția antigenului a fost de 1: 800, diluțiile 5G5 conjugate cu HRP și 3G1 conjugate cu HRP au fost de 1: 6.400 și, respectiv, 1: 12.800; valoarea medie a OD a fost apropiată de 1,0.

inhibarea legării mab la p166W01

rezultatele inhibării sunt prezentate în tabelul 5; legarea antigenului 2B1 conjugat cu HRP de antigenul p166W01 a fost inhibată de 2B1 neconjugat cu inhibare de 68%. Nu a existat o inhibare semnificativă între 2b1 cu mAbs 5G5 și 3G1 (27 și 30%). Inhibarea mai completă a fost obținută din mab heterolog 3G1 și 5G5, pentru legarea HRP-3G1 la antigen a fost inhibată de 5G5 cu inhibare 61%, 5G5 conjugat cu HRP la antigen a fost inhibat de 3G1 cu inhibare 99%. Legarea HRP-3G1 și HRP-5G5 la antigenul p166W01 a fost, de asemenea, aproape complet inhibată de ei înșiși (81 și 80% inhibare). Aceste rezultate sugerează că 3G1 și 5G5 pot împărtăși același epitop sau epitop suprapus, totuși 2B1 recunoaște probabil un epitop diferit.

inhibarea legării mab la p166Chn

rezultatele inhibării sunt prezentate în tabelul 5: legarea HRP-4C5 la p166Chn a fost inhibată de 4C5 neconjugat cu inhibare de 69%, nu a existat o inhibare semnificativă (25 și 30%) obținută din celelalte 2 mab 3G1 și 4C5 neconjugate. Cu toate acestea, o rată de inhibare mai mare a fost obținută din legarea MABS 3G1 și 5G5 conjugate cu HRP la antigen, inhibată de 5G5 și 3G1 neconjugate cu inhibare de 65 și 76%. Legarea 3G1 conjugată cu HRP și 5G5 conjugată cu HRP la antigenul p166Chn a fost, de asemenea, aproape inhibată de la sine. Aceste rezultate sugerează, de asemenea, că 3G1 și 5G5 pot împărtăși același epitop sau epitop suprapus, în timp ce 4C5 recunoaște probabil un epitop diferit.

discuție

de când romanul HEV porcine a fost izolat pentru prima dată , anticorpii anti-HEV au fost raportați la multe animale, au relevat infecția cu HEV în rândul animalelor și al ființelor umane, iar acest lucru poate fi transmis de la animale la ființe umane . Reducerea morbidității și mortalității hepatitei E a depins de prevenirea vaccinului și de diagnosticul eficient. Cunoașterea epitopilor HEV a fost esențială pentru pregătirea vaccinului și dezvoltarea diagnosticului . Detectarea anticorpilor specifici în ser este una dintre principalele metode de diagnosticare și există un număr tot mai mare de teste serologice pentru detectarea anticorpilor. Cu toate acestea, testele utilizate pentru detectarea anticorpilor specifici variază considerabil în ceea ce privește sensibilitatea . Unele teste de diagnostic comerciale bazate pe genotipul 1 sau 2 antigeni nu reușesc să detecteze anticorpi serici împotriva genotipurilor 3 sau 4 izolate . Se știe puțin despre mecanismele care stau la baza necorespondenței diferitelor teste de diagnostic.

în prezent, un sistem de culturi celulare in vitro este încă indisponibil pentru cercetarea HEV. Prin urmare, pORF2 care conține majoritatea situsurilor imunogene a fost utilizat pe scară largă pentru studiul imunologic HEV, cu un caracter dependent de conformație . Baza structurală a unui imunogen pentru a provoca anticorpi neutralizanți și protectori este epitopul neutralizant, care este principala țintă a dezvoltării vaccinului împotriva hepatitei E. Am raportat anterior că proteina p166, o proteină trunchiată a pORF2, poate modela epitopul(epitopii) de neutralizare a HEV, iar anticorpii crescuți împotriva p166 ar putea neutraliza diferite genotipuri ale HEV . În plus, vaccinul împotriva hepatitei E p239 derivat din genotipul 1 HEV a fost eficient într-un studiu clinic de fază 3 efectuat în provincia Jiangsu, China, unde izolatul epidemic de HEV este genotipul 4 . Aceste constatări au arătat că epitopii neutralizanți comuni există în cadrul diferitelor genotipuri ale HEV. Pe lângă epitopul(epitopii) neutralizanți comuni, s-a confirmat existența epitopului(epitopilor) genotip-spe cific (i), pentru prepararea și caracterizarea mAb .

pentru a identifica în continuare caracterizarea epitopilor neutralizanți comuni și specifici genotipului, testul de inhibare competitivă a fost stabilit cu MAB-uri neutralizante comune, 3G1 și 5G5 și mab-uri neutralizante specifice genotipului, 2b1 și 4C5, pentru a investiga legarea concurenței la antigenul p166W01 sau p166chn și pentru a determina dacă mab-urile recunosc epitopi independenți, similari sau care se suprapun.

inițial, fluidele ascitice ale mab 3G1, 2b1, 5G5 și 4C5 au fost produse, purificate și conjugate cu HRP. Metoda ELISA a fost aplicată pentru a compara finitatea af de legare a mab-urilor conjugate cu HRP cu diferite genotipuri de HEV p166. Rezultatele au arătat că HRP-conjugat ed 2B1 a reacționat numai cu genotipul 1 p166W01, dar nu și cu p166Chn. În mod similar, 4C5 conjugat cu HRP a reacționat numai cu p166Chn. În schimb, 3G1 și 5G5 conjugate cu HRP au reacționat bine împotriva proteinelor 2 genotip p166. Deci, testele de legare competitive se bazează pe genotipul 1 și 4 antigeni HEV p166. Rezultatele testelor de legare competitive nu sunt surprinzătoare, adică. că legarea 2B1 la p166W01 a concurat doar de la sine, în timp ce 3G1 și 5G5 s-ar putea concura reciproc pentru legarea la p166W01. Mai mult, legarea 4C5 la p166Chn a fost în mod similar concurată doar de la sine, dar 3G1 și 5G5 s-ar putea concura reciproc pentru legarea la p166Chn. Aceste constatări au indicat faptul că 3G1 și 5G5 recunosc aceiași epitopi sau se suprapun și că 2B1 și 4C5 recunosc altele diferite.

acesta este primul studiu care investighează diferitele caracteristici ale epitopilor neutralizanți conformaționali comuni și specifici genotipului HEV. Am demonstrat că epitopii neutralizanți comuni și specifici genotipului pot fi independenți. Această descoperire este foarte benefică pentru a demonstra mecanismele care stau la baza concordanței scăzute a diferitelor teste de diagnostic. Studiile ulterioare sunt de o importanță crucială pentru elucidarea diferitelor caracteristici ale epitopilor neutralizanți ai HEV în eficacitatea dezvoltării diagnosticului și a preparării vaccinului.

recunoaștere

această lucrare a fost susținută de Fundația de cercetare științifică doctorală a Universității Medicale din Anhui (nr.0110037101).

declarație de dezvăluire

autorii nu declară conflicte de interese.

autor contacte

Detalii articol / publicație

drepturi de autor / dozare de droguri / Disclaimer

drepturi de autor: Toate drepturile rezervate. Nicio parte a acestei publicații nu poate fi tradusă în alte limbi, reprodusă sau utilizată sub nicio formă sau prin orice mijloace, electronice sau mecanice, inclusiv fotocopiere, înregistrare, microcopiere sau prin orice sistem de stocare și recuperare a informațiilor, fără permisiunea scrisă a editorului.
dozarea medicamentelor: autorii și editorul au depus toate eforturile pentru a se asigura că selecția și dozajul medicamentelor prezentate în acest text sunt în conformitate cu recomandările și practicile actuale la momentul publicării. Cu toate acestea, având în vedere cercetările în curs, modificările reglementărilor guvernamentale și fluxul constant de informații referitoare la terapia medicamentoasă și reacțiile la medicamente, cititorul este îndemnat să verifice prospectul pentru fiecare medicament pentru orice modificare a indicațiilor și dozei și pentru avertismente și precauții suplimentare. Acest lucru este deosebit de important atunci când agentul recomandat este un medicament nou și/sau rar folosit.
Disclaimer: declarațiile, opiniile și datele conținute în această publicație sunt exclusiv cele ale autorilor și contribuitorilor individuali și nu ale editorilor și editorilor. Apariția reclamelor sau / și a referințelor produselor în publicație nu reprezintă o garanție, aprobare sau aprobare a produselor sau serviciilor promovate sau a eficacității, calității sau siguranței acestora. Editorul și editorul(editorii) își declină responsabilitatea pentru orice vătămare a persoanelor sau a bunurilor care rezultă din orice idei, metode, instrucțiuni sau produse menționate în conținut sau reclame.