test bilă-esculină pentru identificarea prezumtivă a enterococilor și streptococilor: efectele concentrației biliare, tehnica de inoculare și timpul de incubație

recunoașterea și diferențierea cocilor gram-pozitivi catalazici negativi, alfa-hemolitici și nonhemolitici în perechi și lanțuri ca enterococci; streptococi de grup D (în principalstreptococcus bovis); și streptococi de grup viridani non-grup D sunt importanți din punct de vedere clinic (10). Testul biliar-esculină este utilizat pe scară largă pentru a diferenția enterococii și streptococii din grupa D, care sunt toleranți la bilă și pot hidroliza esculina la esculetină, de la streptococii din grupa D viridani care nu cresc slab pe bilă. Descris pentru prima dată în 1926 De Meyer și Schonfeld (8), testul biliar-esculină a fost demonstrat de Facklam și Moody (2, 3, 5) că are o sensibilitate de 100% și o specificitate de 97% pentru identificarea enterococilor și streptococilor din grupa D. Aceste rezultate au fost obținute cu înclinări de agar conținând 4% oxgall (săruri biliare), inoculate cu 1 sau 2 picături dintr-o cultură Todd-Hewitt de 24 de ore a organismului (inoculare”a doua zi”) și incubate timp de 48 de ore. în bacteriologia de diagnostic de rutină, un astfel de protocol este impracticabil, deoarece necesită 3 zile de la detectarea coloniilor pe plăcile primare. Majoritatea manualelor și manualelor de procedură recomandă inocularea înclinațiilor de agar direct din câteva colonii (inoculare”în aceeași zi”), mai degrabă decât dintr-o subcultură de 24 de ore în bulion, dar lipsesc datele care susțin această tehnică alternativă nestandardizată.

prin urmare, am evaluat sensibilitatea și Specificitatea testului bilă-esculină cu două metode diferite de inoculare în aceeași zi (standardizate și nestandardizate) și două timpi de incubație diferiți (24 și 48 h). De asemenea, am comparat esculin slants conținând 2 și 4% oxgall în formulări disponibile în prezent din două surse comerciale majore din Statele Unite.

cocci Catalazici negativi, gram-pozitivi în perechi și lanțuri care formează colonii alfa-hemolitice sau nonhemolitice pe agar de sânge de oaie 5% care au fost pozitive pentru PYR (Murex, Dartford, Marea Britanie) și au crescut în bulion de soia triptică conținând 6,5% NaCl (Becton Dickinson Microbiology Systems , Cockeysville, Md.) au fost identificați ca enterococi; au fost specializați cu sistemul API rapid Strep (biomecrieux Vitek, Hazelwood, Mo.). Cocci catalazici negativi, gram-pozitivi în perechi și lanțuri care formează colonii alfa-hemolitice sau nonhemolitice care au fost negative pentru PYR, nu au crescut în 6,5% NaCl, au fost pozitivi pentru antigenul de grup D prin aglutinarea latexului (Murex) și au avut un model biochimic sugestiv (probabilitate de 90%) de către sistemul strep rapid API au fost identificați ca S. bovis. Cocci catalazici negativi, gram-pozitivi în perechi și lanțuri care formează colonii alfa-hemolitice sau nonhemolitice care au fost negative pentru antigenul PYR și grupa D (și au fost insolubili în bilă dacă alfa-hemolitic) au fost numiți streptococi de grup viridani.

au fost testate în total 110 tulpini enterococice (34 Enterococcus faecalis, 15 Enterococcus faecium și 61 tulpini nonhemolitice și nespeciate), 30 tulpini S. bovis (2 tulpini alfa-hemolitice și 28 non-hemolitice) și 110 tulpini streptococice din grupul viridans non-grup (83 tulpini alfa-hemolitice și 27 non-hemolitice). Tulpinile au fost izolate consecutiv din culturile de sânge efectuate la Duke University Medical Center pe o perioadă de 4 ani, cu excepția a 19 S. bovisstrains care au fost obținute de la Clinica Mayo.

bacteriile proaspete (24-h) au fost inoculate pe trei inclinații diferite de agar esculin care conțin fie fără bilă (BDMS), 2% oxgall (echivalent cu 20% bilă) (BDMS), fie 4% oxgall (echivalent cu 40% bilă) (Remel, Lenexa, Kans.). Cu excepția oxgall, compozițiile celor trei medii au fost aceleași. Pentru fiecare mediu au fost utilizate următoarele două tehnici de inoculare: (i) inoculare directă, nestandardizată în formă de S, de la 1 la 10 colonii și (ii) inoculare indirectă, standardizată, de 10 ecql (buclă calibrată) a unei suspensii standard de 0,5 McFarland de bacterii în apă sterilă deionizată. Înclinările au fost incubate la 35 de grade C în aerul ambiant (2) cu capace libere timp de 48 de ore. citirile au fost luate la 24 și 48 de ore. o reacție a fost considerată pozitivă atunci când jumătate sau mai mult din mediu a fost înnegrit (4).

cu o singură excepție, toate cele 110 tulpini enterococice au dat reacții pozitive clare după 24 și 48 de ore de incubație (sensibilitate 99%). Inoculul standardizat (aproximativ 106 CFU) a fost la fel de sensibil ca inoculul mai greu, nestandardizat. Facklam și Moody, folosind un inocul de 107 până la 108 CFU pe înclinații de agar, au raportat o sensibilitate de 100% la 48 de ore, dar au găsit 2 din 76 (5) și 6 din 157 (3) tulpini enterococice a fi biliar-esculină negativ (98% sensibilitate) după 24 de ore de incubație. Lebăda (13), folosind un inocul nestandardizat descris ca plăci grele, precum și plăci de agar pe care orice înnegrire a fost considerată a fi un rezultat pozitiv, a obținut o sensibilitate de 100% la 24 de ore cu 121 tulpini enterococice. Cu toate acestea, pe baza publicațiilor Facklam, majoritatea manualelor și manualelor de procedură recomandă incubarea timp de 48 de ore înainte de a raporta un rezultat negativ.

toate cele 30 de tulpini de S. bovis au fost pozitive la 24 și 48 de ore, indiferent de concentrația biliară sau de metoda de inoculare (sensibilitate 100%). Facklam (3) a raportat o sensibilitate de 94 și 100% la 24 și, respectiv, 48 de ore, cu 37 de tulpini streptococice din grupa D.

Tabelul 1 prezintă procentele testelor biliar-esculină fals pozitive pentru 110 tulpini streptococice din grupul viridans non-grup D. Am constatat că specificitatea (100% minus procentul fals pozitiv) a fost maximă (97%) cu un inocul standardizat brăzdat pe pante de agar conținând 4% oxgall și citit după 24 h. fals pozitive au fost obținute cu două Streptococcus milleriși un Streptococcus lactis subsp. diacetilactistrains. Lipsa standardizării inoculului, scăderea concentrației de oxgall la 2% și prelungirea timpului de incubație la 48 h au crescut numărul de fals pozitive la maximum 24%. În studiile anterioare cu un agar esculin selectiv care conține azidă de sodiu și numai 10% bilă, reacțiile pozitive cu streptococi din grupul viridans non-grup d au fost frecvente (6, 11, 12). Nu au fost publicate anterior date privind utilizarea unui mediu care conține 2% oxgall. Rezultatele noastre sugerează că această concentrație este suboptimă. Folosind 4% oxgall, Swan (13) a găsit două tulpini streptococice din grupul viridanilor toleranți la bilă din 21 de izolate; nici o tulpină, cu toate acestea, esculină hidrolizată la 24 h. Facklam și colab. au fost raportate caracteristici specifice de 99% la 24 ore (3) și 81 (4) până la 97% (3) la 48 ore cu 4% oxgall.

o diferență izbitoare a fost găsită atunci când subgrupurile de streptococi din grupul viridans alfa-hemolitic și nonhemolitic non-grup d au fost comparate pentru numărul de fals pozitive. Pentru tulpinile alfa-hemolitice, acest număr a fost 0% după 24 h și 3% după 48 h, în timp ce pentru tulpinile nonhemolitice a fost 11% după 24 h și 33% după 48 h, cu 4% oxgall și un inocul standardizat (P = 0,017 pentru valorile 24-h; testul exact al lui Fisher cu două cozi). O astfel de observație nu a fost raportată anterior.

pentru alte specimene decât sângele și locurile în mod normal sterile, o diagramă de flux bazată pe testul biliar-esculină combinat cu 6,5% toleranță la NaCI sau prezența PYR este suficientă pentru identificarea fiabilă a enterococilor. Organismele biliar-esculină pozitive din sânge și în mod normal locurile sterile ar trebui să fie speciate. Speciația enterococilor este utilă din motive epidemiologice și deoarece E. faecium și alte specii tind să fie mai rezistente la antibiotice decât E. faecalis (8, 9). Identificarea definitivă a SIS. bovis este important, deoarece organismul este asociat cu carcinom de colon, care ar trebui exclus la acești pacienți (7). Pe de altă parte, rapoarte false-pozitive ofS. bovis poate duce la investigații inutile. Speciația organismelor biliar-esculină-pozitive va permite, de asemenea, detectarea streptococilor din grupul viridans non-grup d fals-pozitivi. Erorile terapeutice pot apărea cu identificarea greșită a streptococilor și enterococilor (1). Speciația de rutină a organismelor biliare-esculină-negative nu este necesară, deoarece enterococii și streptococii din grupa D rareori dau reacții fals negative.

în concluzie, testul biliar-esculină funcționează bine pentru a separa rapid enterococii și streptococii din grupa D de streptococii din grupul viridans non-Grupa D la costuri reduse și cu o sensibilitate bună (>99%) și specificitate (97%), cu condiția să fie efectuat pe înclinări de agar conținând 40% bilă, realizat cu un inocul standardizat (10 unqq dintr-o suspensie bacteriană standard de 0,5 McFarland) și citit la 24 h.