tirozinaza
8.14.2.2.4 tirozinaza (EC 1.14.18.1) și catecol oxidaza (EC 1.10.3.1)
tirozinaza, care aparține unei familii de proteine având centrul catalitic format din cupru dinuclear de tip 3, catalizează ortohidroxilarea monofenol și oxidarea ulterioară a produsului Difenolic la Chinona rezultată.178 o serie de reacții apar sub reducerea concomitentă a oxigenului molecular în apă. Produsul Chinon este un precursor Reactiv pentru sinteza pigmenților de melanină. Tirozinaza, care este conținută în legume, fructe și ciuperci, este o enzimă cheie în rumenire care apare la vânătăi sau depozitare pe termen lung. La mamifere, enzima este responsabilă pentru anomalii ale pigmentării pielii, cum ar fi pete și defecte.179 astfel, tirozinaza este destul de semnificativă în domeniile agriculturii și Industriei. În industria cosmetică, dezvoltarea și screeningul inhibitorilor puternici ai tirozinazei sunt deosebit de atractive.
tirozinaza este clasificată în familia proteinelor de cupru de tip 3, la fel ca și catecol oxidaza și hemocianina pigmentului respirator. În timpul reacției catalitice, Centrul de cupru de tip 3 al tirozinazei există în trei forme redox.178 forma deoxi (Cu(I)–Cu (I)) este o specie redusă, care leagă oxigenul pentru a da forma oxi(Cu(II)–O22–cu (II)). În forma oxi, oxigenul molecular este legat sub formă de peroxid într-un mod de punte lateral de la 7-2:2, care destabilizează legătura O–O și o activează. Forma met(Cu(II)–Cu(II)) se presupune ca o formă enzimatică de repaus, unde ionii Cu (II) sunt în mod normal legați de un ligand mic, cum ar fi o moleculă de apă sau un ion hidroxid.
catecol oxidaza oxidează Orto-difenolii la chinonele corespunzătoare, dar nu are activitate de monooxigenază sau crezolază. Hemocianina acționează ca un purtător de oxigen în artropode și moluște.
s-au determinat structurile cristaline ale tirozinazei din Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268 și catecol oxidazei din cartoful dulce Ipomoea batatas180. Acestea confirmă faptul că coordonarea sitului de cupru de tip 3 în tirozinază și catecol oxidază este foarte asemănătoare cu cea găsită în hemocianină. Acest lucru a fost dedus anterior din similitudinea proprietăților spectroscopice și o comparație a multor structuri primare de tirozinază și hemocianină.181-183 pe baza sursei biologice a proteinelor au putut fi identificate șapte organizații de domeniu diferite. Catecol oxidazele vegetale ale diferitelor organisme au o identitate de secvență de aproximativ 40-60%. Identitatea secvenței dintre catecol oxidazele și hemocianinele mulluscane este de aproximativ 35% pe aproape întreaga lungime a secvențelor. În schimb, identitatea secvenței dintre catecol oxidazele vegetale și alte proteine de cupru de tip 3 din orice sursă nonplantă este limitată la cele două regiuni de legare a cuprului.
cele două regiuni de legare a cuprului prezintă cea mai mare conservare în toate proteinele de cupru de tip 3. Mai ales puiul de legare a regiunii este foarte conservat, în timp ce regiunea de legare CuA prezintă mai multă varietate de secvențe și a fost considerată responsabilă pentru diferitele funcții ale tirozinazei, catecol oxidazei și hemocianinei.
structura generală a tirozinazei din S. castaneoglobisporus în complex cu cadru de citire deschis ORF378 este afișat în figura 23. Tirozinaza ia structuri elicoidale cu un nucleu al enzimei, care este format dintr-un pachet cu patru helixuri. Centrul de cupru catalitic dinuclear este depus în pachetul elicoidal (figura 23). Fiecare dintre cei doi ioni de cupru dintr-un sit activ este coordonat de trei reziduuri His (figura 24), care sunt derivate din cele patru helice ale pachetului de la XV, cu excepția His54. Un ion de cupru (desemnat CuA) este coordonat de His38, His54 și His63. His38 și His63 sunt situate la mijlocul străzilor de circulație a mărfurilor, respectiv, în zona de circulație a mărfurilor, în zona de circulație a mărfurilor, în zona de circulație a mărfurilor. Al doilea ion de cupru (CuB) este coordonat de His190, His194 și His216. Reziduurile His190 și His194 se află la începutul și, respectiv, la mijlocul lui 06, iar His216 se află la mijlocul lui 7. Acest centru dicopper este situat în partea de jos a concavității mari ca un buzunar putativ de legare a substratului, care este format din reziduurile hidrofobe. În plus față de structura elicoidală, tirozinaza are câteva structuri de tip centix, după cum se judecă din unghiurile de torsiune ale coloanei vertebrale. În acestea, numai toroanele N-și C-terminale de tip centimetric formează o structură de tablă.
figura 23. Diagrama panglică a tirozinazei din Streptomyces castaneoglobisporus în complex cu ORF378 (Cod PDB: 1wx3). Tirozinaza și ORF378 sunt prezentate în roz și respectiv zmeură. Ionii de cupru CuA și CuB sunt descriși ca sfere galbene; preparat cu PyMOL (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
figura 24. Forma met a centrului activ al tirozinazei din Streptomyces castaneoglobisporus (Cod PDB: 1wx3); preparat cu PyMOL (W. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
deși secvența de aminoacizi a tirozinazei are doar 25,3 și 26,0% identități cu cele ale catecol oxidazei I. batatas180 și domeniul odg al caracatiței dofleini hemocianină,respectiv 184, structura sa generală este destul de similară cu a lor. Dintre aceste trei proteine, se observă un grad ridicat de conservare în domeniul de bază compus din pachetul de la al-VIII-lea. Tirozinaza și hemocianinele din Panulirus interruputus185 și L. polifem66 nu prezintă omologie semnificativă și nici o asemănare în structurile lor, dar domeniile de bază catalitice ale acestor proteine sunt suprapuse.
pentru tirozinaza din S. castaneoglobisporus, cinci stări diferite ale situsului activ ar putea fi caracterizate în structuri cristaline, și anume, forma fără cupru, forma met I, forma met II, deoxi și oxi. În structurile cristaline ale catecol oxidazei din I. batatas au fost elucidate stările met și deoxi, precum și un complex inhibitor. În starea met(Cu(II), Cu (II)) cei doi ioni cuprici se află la o distanță de 2.9, fiecare dintre ele fiind coordonat de trei histidine. Ele sunt legate de un alt atom, cel mai probabil un ion hidroxid, la o distanță de aproximativ 1,8 Inqt față de fiecare ion cupric, astfel încât fiecare dintre ele are un număr de coordonare de 4 (vezi figura 24, care arată aceeași situație pentru tirozinaza de la S. castaneoglobisporus). În starea deoxi sau redusă, ambii atomi de cupru se află în starea de oxidare +1. Distanța cupru-cupru este de 4,4 sec. Numerele de coordonare sunt 4 pentru CuA (trei liganzi de histidină și o moleculă de apă coordonatoare) și 3 pentru CuB (trei liganzi de histidină). Sfera de coordonare este distorsionată piramidal trigonal pentru CuA și pătrat planar pentru CuB (locul de coordonare ocupat de punte OH− În starea met este vacant). În complexul inhibitor cu feniltiouree (PTU), distanța cupru–cupru crește până la 4,2 inkt cu atomul de sulf al PTU înlocuind puntea hidroxo a stării met. Sferele de coordonare ale celor doi copperi rămân similare cu cele ale statului met, dar există modificări conformaționale la reziduurile sitului activ. Cea mai semnificativă schimbare este o rotație a inelului aromatic al Phe261 (numerotarea catecol oxidazei).
în comparație cu starea met, reziduurile de coordonare au doar poziții ușor diferite în starea redusă, indicând un buzunar destul de rigid. Modificările de coordonare sunt asociate cu mișcările atomilor de cupru din buzunar. Complexul inhibitor arată că Phe261 este situat deasupra sitului activ ca o poartă, care se rotește după legarea inhibitorului. Astfel, accesul substratului la Centrul metalic catalitic pare a fi controlat de acest’reziduu de poartă’.
mecanismul catalitic al tirozinazei a fost studiat pentru prima dată în detaliu de Solomon și colab.178 Solomon a propus un mecanism atât pentru activitățile crezolazei, cât și pentru catecolaza tirozinazei (figura 25). Acest mecanism sugerează că starea oxi este punctul de plecare al activității crezolazei (cercul interior). Această stare este prezentă în forma de repaus a tirozinazei într-o proporție de aproximativ 15% (85% stare met). Un substrat monofenol se leagă de starea oxi și este monooxigenat la o-difenol. Acest difenol se leagă ulterior de centrul de cupru al tirozinazei met într-un mod de legare bidentat propus pe baza unui compus model.188 oxidarea substratului difenol conduce la starea redusă a Centrului de cupru dinuclear. Reoxidarea stării reduse la starea oxi are loc prin atacul dioxigenului și închide ciclul catalitic.
figura 25. Mecanismul activității crezolazei și catecolazei tirozinazei și catecol oxidazei s-a dezvoltat pe baza unei propuneri inițiale a lui Solomon și a colaboratorilor178 și a inclus rezultate mai recente.186.187 reprodus de la C. Gerdemann; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Chem. Res. 2002, 35, 183-191, cu permisiunea American Chemical Society.
mecanismul activității catecolazei (cercul exterior) începe de la stările oxi și met. Un substrat de difenol se leagă de starea met (de exemplu), urmată de oxidarea substratului la prima chinonă și formarea stării reduse a enzimei. Legarea dioxigenului duce la starea oxi, care este ulterior atacată de a doua moleculă de difenol. Oxidarea la a doua chinonă formează din nou starea met și închide ciclul catalitic.
mecanismele alternative de reacție includ un mecanism radical propus de Kitajima și Morooka189 și un mecanism care implică un intermediar Cu(III) bazat pe măsurători ale compușilor model.190 pe baza structurii cristaline a complexului inhibitor catecol oxidază–PTU, s-a sugerat legarea monodentatului substratului pentru catecol oxidază.180 un mecanism radical,așa cum a fost propus pentru activitatea slabă a catecolazei Găsită în caracatița vulgaris hemocianină, 191 este, de asemenea, posibil pentru catecol oxidază datorită relației structurale puternice dintre catecol oxidaza din I. batatas și ODG hemocianină așa cum este descris mai sus.
diferența distinctă dintre catecol oxidază și tirozinază nu a fost încă explicată. A fost găsită și studiată o fază de lag în activitatea monofenolazei tirozinazei și se propune a fi rezultatul inhibării temporare a stării tep a tirozinazei prin excesul substratului monofenol (figura 25).186 activitatea Monofenolazei crește atunci când produsul difenol deplasează monofenolul din met tirozinază și permite continuarea ciclului catalitic. Catecol oxidaza în forma sa izolată este prezentă exclusiv în starea met și este, de asemenea, inhibată de fenol. Prin urmare, s-a sugerat că lipsa stării oxi este motivul pentru care catecol oxidazei îi lipsește activitatea crezolazei. Deoarece oxi catecol oxidaza nu prezintă nici o activitate a monooxigenazei, această explicație nu pare pe deplin satisfăcătoare. Un alt motiv posibil este că accesul la CuA, care a fost propus a fi necesar pentru oxigenarea monofenolilor,192 este blocat în structura cristalină a catecol oxidazei de la I. batatas.