Toxina Clostridium difficile B

când reziduul catalitic de treonină al glucoziltransferazei dezactivează o familie de Gtpaze mici,de exemplu familia Rho; Rac și Cdc42 din interiorul celulelor țintă perturbă mecanismele de transducție a semnalului, ceea ce duce la disfuncționalitatea citoscheletului actinei, a joncțiunii celulă-celulă și a apoptozei (Fig. 5). Rho induce activitatea fibrelor de stres de actină. Proteinele Rac controlează activitățile de rupere a membranei și neutrofilele NADPH-oxidazei. Cdc42 reglează formarea filamentului F-actinei în filopodia.

Citotoxicitateamodificare

mai multe studii au demonstrat că prezența TcdB în celulele mamiferelor duce la schimbări rapide în morfologia celulară și semnalizarea celulară. Într-o perioadă scurtă de timp, celulele au aspectul plăcii cu doze mici de TcdB și TcdA. În plus, moartea celulelor este un impact major al acestor toxine după ce celulele au fost intoxicate. O anchetă a lui Donta și colab., transmis că TcdB are efecte grave asupra altor celule de mamifere, cum ar fi celulele ovariene de hamster chinezesc, celulele epiteliale cervicale umane, celulele suprarenale de șoarece, hepatocitele de șobolan și astrocitele de șobolan (Fig.3).

activitatea citotoxică se bazează pe tipuri de celule, care pot varia de la 4 la 200 de ori. În general, atunci când celulele sunt infectate cu TcdB, acestea nu numai că își pierd integritatea structurală, ci și diminuările filamentelor de f-actină. Rotunjirea celulelor prin TcdB nu durează mai mult de 2 ore (Fig. 4), dar în ceea ce privește moartea celulară, poate dura aproximativ 24 de ore. În ceea ce privește diareea asociată cu Clostridium difficile (CDAD), efectele citopaticității sunt mai critice decât moartea celulară reală, deoarece odată ce celulele pierd integritatea filamentului de actină citoschelet, își pierd și funcția normală.

efecte asupra GTPasesEdit mici

cauza activității citotoxice de către TcdB în celula gazdă este mediată în principal prin endocitoza receptorilor. Endozomii acizi permit toxinei B să intre în citosol. Acest fenomen are loc printr-o regiune a receptorilor de legare, care permite toxinei să intre în celulele gazdă. Prin accesibilitatea citosolului celulelor gazdă, TcdB dezactivează Gtpazele mici (Fig. 5), de exemplu, membrii familiei Rho Rac și Cdc42 prin procesul de glicozilare a treoninei 35 în Cdc42 și Rac și a treoninei 37 în Rho. Aceste Rho Gtpaze se găsesc omniprezent în citosolul celulelor eucariote care sunt responsabile de organizarea citoscheletului actinei, deoarece toxinele din citosol provoacă condensarea filamentelor de actină ca o consecință a rotunjirii celulare și a blebbingului membranei (Fig. 3), ceea ce duce în cele din urmă la apoptoză. TcdB provoacă modificări critice ale dinamicii și morfologiei celulare. Figura 3 prezintă efectul probabil al toxinei B asupra suprafeței unei celule; blebbing cu membrană (săgeți negre). În plus, TcdB inactivează Gtpazele Rho. Ca o consecință, joncțiunile celulare-celule sunt perturbate, ceea ce sporește permeabilitatea epitelială a toxinei B și acumularea de lichide în lumen. Acesta este unul dintre principalii agenți cauzali în contractarea diareei asociate cu Clostridium difficile (CDAD)(Fig. 5).

mai mult, rata de hidroliză de către TcdB a UDP-glucozei este de aproximativ cinci ori mai mare decât TcdA. Mai multe studii au indicat faptul că Rho prezintă modificări posttranslaționale prin prenilare și carboximetilare, care are loc în partea citoplasmatică a membranei plasmatice, Prin urmare, schimbul de GTP la PIB. Când TcdB se leagă de Rho și alte Gtpaze mici, GTP hidrolizează la PIB, ceea ce duce la GTP-legat (activ) la PIB-legat (inactiv) (Fig. 5). În plus, această activitate de schimb este reglementată de factorii de guanină din citosolul celulei.

perturbarea căilor de semnaledit

reglarea celulară a Rho, Rac și Cdc42 are efecte în afara vecinătății filamentelor de actină ale citoscheletului (Fig. 4), Aceste Gtpaze mici sunt încorporate în ciclul celular care reglează semnalele prin intermediul protein kinazei kinaze activate de mitogen (MAPKKs). Unele părți fiziologice ale celulelor care nu sunt implicate în filamentele de actină, nu pot provoca rotunjirea celulelor sau moartea celulelor imediat, dar în activitatea căii din aval, pot duce la deteriorarea filamentelor de actină și, în final, la moartea celulelor.

în 1993, un studiu realizat de Shoshan și colab., a arătat că celulele cu TcdB au schimbat activitatea fosfolipazei A2. Acesta a fost un eveniment independent de întreruperea citoscheletului actinei. Shoshan și colab., de asemenea, a arătat că TcdB a inhibat activitatea de semnalizare a receptorului prin dezactivarea proteinelor Rho prin fosfolipaza D.

formarea Poriloredit

TcdB accesează interiorul celulei prin endocitoză mediată de clatrină, când toxina B face parte din citosol, glucoziltransferaza trece prin membrana endozomală, care scade pH-ul, induce translocarea și duce în final la modificări morfologice ale reziduurilor regiunii de translocare (958-1130). Regiunile hidrofobe sunt încorporate în membrana gazdă pentru a forma pori care permit trecerea domeniilor glucoziltransferazei. Când celulele sunt infectate cu TcdB într-un mediu acid, atenuează toxinele și provoacă rearanjări ale formei (Fig. 6). Ca o consecință a pH-ului acid, TcdB afișează diferențe clare în fluorescența originală a triptofanului, susceptibilitatea proteazelor și suprafețele hidrofobe. Un alt grup a arătat că acidificarea duce la modificări conformaționale ale toxinei și, mai important, ajută la formarea porilor. O regiune de translocație presupusă ( Fig. 2) reprezintă aproximativ 801-1400 aminoacizi, dintre care reziduurile 958-1130 sunt hidrofobe și sunt responsabile pentru formarea porilor transmembranari. Majoritatea studiilor au folosit tulpina TcdB 630 pentru a arăta activitatea de formare a porilor de toxine C. difficile.

indus de pHEdit

pentru a vedea dacă efectele scindării proteolitice a TcdB au loc la suprafața celulei sau în endozomii acizi, studiile au utilizat Bafilomicina A1, despre care se știe că blochează tipul V H+-Atpazele endozomilor. Aceasta reduce aciditatea în endozomi. Calea de absorbție fiziologică a TcdB previne activitatea citopatică de către TcdB. Când celulele au fost în condiții acide (pH 4,0) timp de 5 minute după legarea TcdB la suprafața celulei la 37 de grade Celsius, s-au observat rearanjările formei și rotunjirea. Cu toate acestea, atunci când celulele rotunjite au fost incubate timp de o oră suplimentară la pH neutru (7,0) cu parametri similari, nu s-a observat rotunjirea celulelor. Ambele studii au arătat că toxina B are o proprietate de scindare proteolitică, care este esențială pentru accesul la citosol. Având un pH acid al endozomului duce la modificări topologice ale TcdB (Figura 6).

GeneticsEdit

gena care codifică proteina TcdB, tcdB, este localizată în regiunea cromozomială de 19,6 kb. Acest lucru este cunoscut sub numele de locus de patogenitate sau PaLoc (Figura 2). Cadrul de citire deschis (ORF) pentru tcdB are o lungime de 7.098 nucleotide. Este important de menționat că—pe lângă genele majore de toxine din regiunea PaLoc—există alte trei gene accesorii care codifică în regiunea PaLoc: tcdR( L), tcdC (R) și tcdE în mijloc. Aceste gene ajută la reglarea expresiei TcdA și TcdB. De asemenea, ajută la secretarea sau eliberarea toxinelor din celulă. Gena de codificare tcdE, situată între tcdB și tcdA, este analogă proteinelor holinice, astfel, se sugerează că tcdE funcționează ca o genă facilitatoare care îmbunătățește eliberarea sau secreția TcdA și TcdB crescând în consecință permeabilitatea membranei celulei gazdă.

detectarea Toxineloredit

există diferite dimensiuni plasmidice ale C. difficile. Greutățile moleculare detectate variază de la 2, 7×106 la 100×106, dar dimensiunile plasmidelor nu prezintă nicio corelație cu toxicitatea. Pentru a detecta nivelul de toxină B în C. difficile, clinicienii folosesc pe scară largă teste pe culturi celulare derivate din probe de scaun de la pacienți cu PMC. Testul pe culturi celulare este considerat un „standard de aur” pentru detectarea toxicității în C. difficile, deoarece o cantitate mică de toxină B este capabilă să provoace rotunjirea celulelor (Fig. 4), astfel, este un avantaj major al laboratoarelor clinice de a face corelații cu CDAD cauzate de TcdB. Deși activitatea citotoxică a toxinelor clostridiale mari (LCT) a fost găsită în probele de scaun ale pacientului PMC, activitatea toxinei B a avut efecte citotoxice mai dăunătoare în comparație cu toxina A. Prin urmare, activitatea toxinei A este atenuată atunci când nu este izolată de toxina B. detectarea toxicității C. difficile este extrem de sensibilă, cu toate acestea, utilizarea testului pe culturi celulare permite laboratoarelor clinice; utilizarea unor doze mai mici de 1 pg/mL de toxină B este suficientă pentru a determina rotunjirea celulelor. Acesta este avantajul major în utilizarea testului de țesut de cultură pentru a detecta toxicitatea la pacienții cu PMC. Chiar dacă laboratoarele clinice au încercat să utilizeze un test imunosorbent legat de enzimă cu placă microtitrică (ELISA) și alte tehnici pentru a detecta activitatea citotoxică a toxinei B în fecalele pacienților cu PMC, rezultatele nu sunt la fel de exacte ca cele în care au fost utilizate teste pe culturi celulare.

factor de Producțieredit

prin adăugarea de antimicrobiene, de ex. clindamicina, în mediul de creștere a culturii, studiile au arătat că activitatea citotoxică în culturile C. difficile crește de 4-8 ori. Mai mult, cunoscând rolul antibioticelor asupra cauzelor PMC, multe studii anterioare s-au concentrat asupra efectelor producției de toxine antimicrobiene. Ca rezultat, studiile au putut concluziona că natura subinhibitorie a nivelurilor de vancomicină și penicilină a crescut producția de toxine în culturile de C. difficile. Cantitățile de producție de toxine au fost corelate cu utilizarea mediului de creștere pentru organisme. Un alt studiu a ilustrat faptul că nivelurile ridicate de producție de toxine ale TcdB au fost observate în medii complexe, cum ar fi bulionul de perfuzie a creierului și a inimii. Nivelurile ridicate de toxine au fost produse cu izolarea extrem de virulentă. În schimb, nivelurile scăzute de toxine au fost produse cu izolarea slab virulentă. Astfel, arată că producțiile de toxine au fost co-reglementate. Deși mecanismul din spatele implicării mediului în modularea semnalelor care exprimă toxinele nu este înțeles, studiile in vitro au arătat că expresia toxinei este întărită de reprimarea catabolitului și de stres, de exemplu antibiotice. Un alt studiu a arătat că limitarea biotinei în mediu bine caracterizat crește producția de TcdB de 64 de ori și TcdA de 35 de ori. Acest lucru a fost făcut cu C. difficile și doze de biotină de până la 0,05 nM. Mai multe alte studii timpurii au argumentat împotriva teoriei că producția de toxină are ceva de-a face cu stresul sau reprimarea catabolită a toxinei TcdA sau TcdB. De asemenea, multe studii spun că principalul motiv pentru diferențele dintre alte studii se datorează producției de toxine care nu apare cu toate izolatele de C. difficile.