Cellbiologi 06: cytoskelettet del II: Tubulin

dessa är anteckningar från föreläsning 6 i Harvard Extension Cell Biology course.

förra veckan täckte vi mikrofilament, som är gjorda av aktin. Denna vecka: mikrotubuli, gjord av tubulin. Varför frågar du, behöver cytoskeletten två separata system? Tänk på att mikrofilament bara är kedjor av enskilda underenheter, medan mikrotubuli är bokstavligen rör (som vi kommer att se inom kort) – ihåliga cylindrar med väggar av kedjor av dimerer. Dessa olika strukturer betyder olika förmågor: mikrofilament kan lättare bildas spontant och kan förgrena sig (med hjälp av Arp2/3 och andra komplex som diskuterades förra gången) för att bilda olika nätverksformer och ansluta olika delar av cellen. Mikrotubuli är mer beroende av kärnbildning för att bilda, och är i grunden ett talade nätverk som förbinder centrosomen med cellens periferi. I praktiken är mikrofilament rikliga i cellbarken och starkt involverade i kontraktila rörelser och cellmotilitet, medan mikrotubuli är mest involverade i att organisera organeller och fungera som spår för anterograd och retrograd transport.

mikrotubuli

(bild tack vare Wikimedia Commons-användaren Jeffrey81)

förutom Wikipedia är tidigare utgåvor av läroböckerna Lodish och Cooper cell biology som finns tillgängliga på NCBI också utmärkta referenser.

den rörformiga strukturen hos mikrotubuli är robustare än mikrofilament, vilket möjliggör mycket kraftig dragning och tryckning. Även om de är robusta, är mikrotubuli temperaturberoende-de depolymeriserar om de kyls till 4 kg C och kommer att repolymerisera igen om de värms till 37 kg c förutsatt att GTP är tillgängligt.

den grundläggande byggstenen för mikrotubuli är en tubuilin-tubulin-dimer (kodad av TUBA_-gener respektive TUBB_-gener). De enskilda tubulinproteinerna väger vardera ~55kDa, så vid ~110da / aminosyra som är i storleksordningen 500 aminosyror. Både tubulin och tubulin binder GTP, men i stort sett håller det bara fast vid det för alltid, medan det i tubulin kan bytas ut eller hydrolyseras till BNP och sedan bytas ut mot ny GTP igen.

strängar av på varandra följande Xiaomi-dimerer utgör protofilament, och 13 protofilament anordnade sida vid sida i en cylinder gör en mikrotubuli. Utrymmet mellan protofilamenten kallas en ’söm’. Hela mikrotubuli är ~25 nm i diameter. Du kan se dess struktur (gjord av dimerer och protofilament) i Cellsegmentets inre liv om mikrotubuli:

inom varje dimer är subenheten för exporterande tillverkare (+) änden, gynnad för polymerisation och den exporterande tillverkaren (-) änden, gynnad för depolymerisation. Mikrotubuli bildas i princip samma tre steg som mikrofilament – kärnbildning, förlängning och steady state. Men till skillnad från mikrofilament kärnbildar de inte lätt på egen hand, så kärnbildning kräver mikrotubuli organiserande centra (MTOCs). Icke-delande celler har vardera bara en MTOC, kallad centrosomen. (Detta visas också i videon ovan). Beläget nära kärnan är centrosomen navet till en radiell konfigurering av mikrotubuli med ( – ) ändar pekade in och ( + ) ändar som pekar mot cellperiferin.

centrosomen består av 2 cylindrar som kallas centrioler. Varje centriol består av varje 9 uppsättningar av 3 lateralt sammansmälta mikrotubuli, omgiven av ett amorft ’pericentriolärt material’ rikt på saker som främjar kärnbildning – särskilt tubulin-tubulinringkomplex (gamma tubulin kodas av TUBG_-generna). tubulin är tänkt som en ’delad bricka’:

modellen är att de delade ändarna gör det möjligt för tubulin att binda till tubulin-det vill säga ( – ) änden av en till-formad mikrotubuli-vilket ger kärnbildningsfröet för att en mikrotubuli ska bildas.

mikrotubuli kan bildas in vitro. Dynamiken beror mest på kritiska koncentrationer. (- ) Änden är mindre benägen mot polymerisation än ( + ) änden, så den har en högre kritisk koncentration. Om den faktiska koncentrationen är mellan de två ändarna kritiska koncentrationer, löpband inträffar.

när en mikrotubuli plötsligt börjar dissociera kallas detta en ’katastrof’. Katastrofer har en intressant energisk dynamik. Minns från tidigare att beta-tubulin, som är (+) änden där förlängning händer, kan vara antingen GTP – eller BNP-bunden. Det är en mer stabil del av dess mikrotubuli när den är GTP-bunden; BNP-bunden tubulin är benägen att dissociera. Mikrotubuli bildas främst genom tillsats av GTP-bunden beta-tubulin vid (+) änden, men efter tillsats hydrolyserar beta-tubulinmolekylerna senare deras GTP och lämnar dem BNP-bundna. Så det finns ett slags ’spets’ av mikrotubuli som är GTP-bunden, medan beta-tubulin djupare ner mikrotubuli, läggas längre sedan, är BNP-bundna. Om gränsen för GTP-hydrolys fångar upp till spetsen, eller om något händer för att bryta mikrotubulen, blir det mindre stabila, BNP-bundna beta-tubulinet exponerat, och protofilamenten kommer att börja skrälla bort som ”ramens horn”. Om detta händer kommer mikrotubulen att demonteras tills den träffar en ”ö” av GTP-bunden beta-tubulin någonstans längre ner i halmen. Katastrof kan ’räddas’ genom tillsats av nya GTP-bundna tubulindimerer som kommer att täcka ändarna och stabilisera protofilamenten, vilket gör att mikrotubulen kan omformas. Du kan se i den här videon att depolymerisering av mikrotubuli kan vara mycket snabbare än polymerisation:

här är några föreningar som är användbara för att studera mikrotubuli. Kolchicin, ett läkemedel mot gikt, binder fria alfa-beta-dimerer, vilket minskar deras tillförsel för mikrotubulbildning och därmed främjar depolymerisering. Nocodazol stör också ny mikrotubulbildning, och eftersom bildandet av nya mikrotubuli är viktigt för mitos är nocodazol ett antineoplastiskt cancerläkemedel. Omvänt fungerar paklitaxel (taxol), ett annat läkemedel mot cancer, genom att stabilisera mikrotubuli, eftersom nedbrytning av befintliga mikrotubuli också är viktigt för mitos.

mikrotubuli-associerade proteiner (MAPs) har olika roller. Anmärkningsvärt är MAP4 (i icke-neuronala celler), MAP2 (i neuroner) och Tau (i neuroner; kodad av MAPT-gen). Alla dessa har gemensamt att de agerar för att stabilisera mikrotubuli, förskjuta kinetiken till förmån för mikrotubultillväxt och mot katastrof. Var och en innehåller en 18 aminosyrasträcka med positivt laddade aminosyror som binder till den negativa delen av mikrotubuli. De kan agera för att bunta flera mikrotubuli tillsammans , med MAP2 som håller mikrotubuli på ett större avstånd på grund av dess längre arm (jämfört med Tau).

kartorna regleras genom fosforylering: MARK-proteinkinaserna binder kovalent fosfatgrupper till S -, T-eller Y-aminosyror i MAP-proteinerna, vilket minskar deras förmåga att binda mikrotubuli. (Cyklinberoende kinaser reglerar också kartorna under mitos). Man tror att dessa kartor verkar för att bestämma den fysiska strukturen hos celler. I neuroner finns MAP2 i dendriter och Tau är mestadels i axonen. Mutationer i MAPT-genen som kodar för Tau orsakar frontotemporal demens (FTD). Hyperfosforylerad Tau finns (även om vi inte vet varför) i Alzheimers patienters hjärnor. Musmodeller av båda dessa sjukdomar visar axonal degeneration, i överensstämmelse med att Tau inte kan göra sitt jobb med att stabilisera mikrotubuli i axonen.

en annan klass av proteiner, som heter +Tips för deras bindning till (+) slutet av mikrotubuli, kan skydda mot katastrof. De verkar förlänga ett rättvist sätt ner i mikrotubuli. Denna video visar att EB – 1 skjuts utåt eftersom ändarna på mikrotubuli växer:

andra slutbindande proteiner främjar katastrof snarare än stabilitet. Kinesin – 13 verkar för att kurva slutet av protofilamenten och sänka tröskeln för katastrof. Stathmin (stmn1-gen; aka Op18, där Op står för onkoprotein) binder till tubulindimerer inom ett protofilament, vilket främjar både omedelbar katastrof och eventuellt också GTP-hydrolys, vilket genom att ta bort ”öar” av GTP-bunden beta-tubulin skulle representera mer av en långsiktig investering till förmån för katastrof. Stathmin regleras genom fosforylering. Katanin (efter det japanska svärdet katana) skär bokstavligen mikrotubuli.

mikrotubulära motorproteiner liknar till stor del mikrofilamentmotorproteiner. De kommer i två familjer: kinesiner, varav de flesta rör sig anterograd, dvs mot (+) änden; och dyneiner, varav de flesta rör sig retrograd, dvs mot (-) änden. De’ går ’ så här:

Kinesin och dynein är involverade i rörliga organeller, endocytos och exocytos och kromosomsegregering under meios & mitos.

Kinesin-1, den bäst studerade av kinesinerna, är ett ’konventionellt’ kinesin genom att det fungerar som en tetramer som består av två tunga kedjeenheter (KIF1-gener t. ex. KIF1A) som omfattar huvuddomänerna som hydrolyserar ATP och binder mikrotubuli, och två lätta kedjeenheter (KLC-gener t.ex. KLC1) som innefattar en svans som binder lasten, i detta fall vesiklar. En länkdomän (vilket protein är den här delen av?) möjliggör dimerisering av två tunga kedjor.

här är en video av det i aktion. Observera att videon kallar det en dimer istället för en tetramer; jag tror att det beror på att de bara överväger huvudet och inte diskuterar svansarna.

några av de andra kinesinerna skiljer sig lite:

• Kinesin-2, som också gör vesikel & organelltransport, är en heterotrimer med två olika (men relaterade) tunga kedjor och en annan polypeptid som den använder för att reglera sin last.
• Kinesin-5 har huvuden i båda ändarna istället för huvud och svans, så att den går i motsatta riktningar på två olika mikrotubuli och drar dem ihop. Detta kallas bipolär rörelse.
• Kinesin-14 är det enda kända kinesin som rör sig mot (-) änden, och det är involverat i mitos.

principerna för ’walking’ – rörelsen är dock ungefär desamma för alla kineser och är vad som visas i den sista videon ovan. När de inte är bundna till en mikrotubuli är ’huvuden’ båda ADP-bundna. Ett huvud kommer att stöta på en mikrotubuli och binda till den, släppa sin ADP, så att en ATP kan ersätta den. ATP-bindningen inducerar konformationsförändring som drar på länkaren, svänger den andra, ’släpar’ huvudet framåt i ledande position där det binder till mikrotubuli. Det ursprungliga huvudet hydrolyserar sedan ATP som frigör fosfat (som förkortas som Pi i videon) och ger energin för det energiskt uppförsbacke i denna process, som bryter bort från mikrotubuli.

Myosin (motorproteinet som går på mikrofilament) och kinesin har mycket liknande strukturer men ingen aminosyrasekvenslikhet. Således tros de inte vara paraloger, utan snarare ett exempel på konvergent evolution.

folk pratar mycket om kineser delvis för att vi inte förstår dyneins lika bra. Dyneiner är enorma proteiner, gjorda av 2 stora, 2 mellanliggande och 2 små underenheter. Deras storlek har gjort dem svåra att isolera och karakterisera och deras arbete är inte väl förstått. Vi vet att dynactinkomplexet (ett multiproteinkomplex; dynactinerna själva är dtcn_-generna) är involverat som en ’adapter’ som länkar dynein till last.

denna video sammanfattar hela cytoskelettet och repen i mycket av materialet från förra veckan och denna föreläsning:

PrP

som nämnts i sekretoriska väganteckningar är PrP GPI-förankrad i membranet och genomgår endocytos mycket regelbundet, vilket skapar endocytiska vesiklar med PrP i dem. Encalada 2011 finner att Kinesin – 1c och DHC1 (dynein heavy chain 1) är ansvariga för att transportera dessa PrP-vesiklar anterograd respektive retrograd. När Encalada slog ut, slog ner eller hämmade Kinesin-1C reducerades anterograd och retrograd rörelse, och på samma sätt när DHC1 stördes. Så det verkar som om dessa två komplex, även om de rör sig i motsatta riktningar, aktiverar varandra. Och intressant, att störa dessa motorproteiner hindrade inte PrP-vesiklar från att associera med motorer – de rörde sig bara inte så fort eller så ofta. Papperet har ett antal andra cellbiologiska slutsatser om arten av hur vesiklar aktiverar motorproteiner och hur transportriktningen bestäms.