Clostridium difficile toxin B

när den katalytiska treoninresten av glukosyltransferas inaktiverar en familj av små Gtpaser, t.ex. Rho-familjen; Rac och Cdc42 inuti målcellerna stör signaltransduktionsmekanismer, vilket leder till dysfunktion av aktincytoskelett, cell-cellkorsning och apoptos (Fig. 5). Rho inducerar aktiviteten hos aktinspänningsfibrer. Rac-proteiner kontrollerar aktiviteterna för membranruffling och NADPH-oxidas neutrofil. Cdc42 reglerar f-aktinfilamentbildningen i filopodia.

Cytotoxicitetredigera

flera studier har visat att närvaron av tcdb i däggdjursceller leder till snabba förändringar inom cellmorfologi och cellsignalering. Inom en kort tidsperiod har celler utseende av plack med små doser av TcdB och TcdA. Dessutom är cellernas död en stor inverkan av dessa toxiner efter att cellerna har berusats. En undersökning av Donta et al., vidarebefordrade att TcdB har allvarliga effekter i andra däggdjursceller, såsom äggstocksceller från kinesisk hamster, humana livmoderhalsepitelceller, musadrenalceller, råtthepatocyter och råttastrocyter (Fig.3).

den cytotoxiska aktiviteten är baserad på celltyper, som kan sträcka sig från 4 gånger till 200 gånger. I allmänhet, när celler infekteras med TcdB, förlorar de inte bara sin strukturella integritet utan också minskningar av f-aktinfilament. Cellrundningar av TcdB tar inte längre än 2 timmar (Fig. 4), men när det gäller celldöd kan det ta cirka 24 timmar. När det gäller Clostridium difficile-associerad diarre (CDAD) är effekterna av cytopaticitet mer kritiska än faktisk celldöd eftersom när celler förlorar integriteten hos cytoskeletonaktin, förlorar de också sin normala funktion.

effekter på små GTPasesEdit

orsaken till cytotoxisk aktivitet av TcdB i värdcellen förmedlas huvudsakligen via receptorendocytos. Sura endosomer tillåter toxin B att komma in i cytosolen. Detta fenomen äger rum av en bindande receptorregion, vilket gör det möjligt för toxin att komma in i värdceller. Genom tillgängligheten av värdcellernas cytosol inaktiverar TcdB de små Gtpaserna (Fig. 5), t.ex. Rho-familjemedlemmarna Rac och Cdc42 genom processen för glykosylering av treonin 35 i Cdc42 och Rac, och treonin 37 i Rho. Dessa Rho Gtpaser finns allestädes närvarande i cytosolen hos eukaryota celler som är ansvariga för organisationen av aktincytoskelettet eftersom toxinerna i cytosolen orsakar kondensation av aktinfilament som en följd av cellrundning och membranblebbing (Fig. 3), vilket i slutändan leder till apoptos. TcdB orsakar kritiska förändringar i celldynamik och morfologi. Figur 3 visar den sannolika effekten av toxin B på en Cells yta; membranblebbing (svarta pilar). Dessutom inaktiverar Tcdb Rho Gtpaser. Följaktligen störs cellcellskorsningar, vilket ökar epitelpermeabiliteten hos toxin B och vätskeansamling i lumen. Detta är ett av de främsta orsaksmedlen vid kontraherande Clostridium difficile-associerad diarre(CDAD) (Fig. 5).

dessutom är hydrolyshastigheten av TcdB av UDP-glukos ungefär fem gånger större än TcdA. Flera studier har visat att Rho uppvisar posttranslationell modifiering genom prenylering och karboximetylering, som förekommer i den cytoplasmatiska sidan av plasmamembranet, följaktligen utbytet av GTP till BNP. När TcdB binder till Rho och andra små Gtpaser hydrolyserar GTP till BNP, vilket leder till GTP-bunden (aktiv) till BNP-bunden (inaktiv) (Fig. 5). Dessutom regleras denna utbytesaktivitet av guaninfaktorer i cellens cytosol.

störning på signalvägaredit

den cellulära regleringen av Rho, Rac och Cdc42 har effekter utanför närheten av aktinfilamenten i cytoskelettet (Fig. 4) införlivas dessa små Gtpaser i cellcykeln som reglerar signaler via mitogenaktiverade proteinkinaskinaser (MAPKKs). Vissa fysiologiska delar av cellerna som inte är involverade i aktinfilament kan inte orsaka cellrundning eller celldöd direkt, men i nedströms vägaktivitet kan leda till försämring av aktinfilament och slutligen celldöd.

1993, en studie utförd av Shoshan et al., visade att celler med TcdB förändrade fosfolipas A2-aktivitet. Detta var en oberoende händelse från störning av aktincytoskelettet. Shoshan et al., visade också att TcdB hämmade receptorsignaleringsaktiviteten genom att deaktivera Rho-proteinerna via fosfolipas D.

Porbildningedit

TcdB får åtkomst till cellens inre genom klatrinmedierad endocytos, när toxin B är en del av cytosolen passerar glukosyltransferaset genom det endosomala membranet, vilket minskar pH, inducerar translokation och slutligen leder till morfologiska förändringar av translokationsregionrester (958-1130). De hydrofoba regionerna är inbäddade i värdmembranet för att bilda porer som tillåter glukosyltransferasdomäner att passera igenom. När celler infekteras med TcdB i en sur miljö dämpar den toxiner och orsakar formarrangemang (Fig. 6). Som en följd av surt pH visar TcdB tydliga skillnader i ursprunglig fluorescens av tryptofan, mottaglighet av proteaser och hydrofoba ytor. En annan grupp har visat att försurning leder till konformationsförändringar av toxinet och, ännu viktigare, hjälper till att bilda porer. En förmodad translokationsregion (Fig. 2) utgör cirka 801-1400 aminosyror, varav rester 958-1130 är hydrofoba och är ansvariga för bildandet av transmembranporer. En majoritet av studierna använde tcdb-stam 630 för att visa porbildningsaktiviteten hos C. difficile-toxiner.

inducerad av pHEdit

för att se om effekterna av proteolytisk klyvning av TcdB äger rum vid cellytan eller i sura endosomer, använde studier Bafilomycin A1, vilket är känt för att blockera v-Typ H+-Atpaser av endosomer. Detta minskar surheten i endosomer. Den fysiologiska upptagningsvägen för TcdB förhindrar cytopatisk aktivitet av TcdB. När celler var i sura betingelser (pH 4.0) i 5 minuter efter bindning TcdB till cellytan vid 37 grader Celsius observerades formarrangemangen och avrundningen. Men när rundade celler inkuberades i ytterligare en timme i neutralt pH (7,0) med liknande parametrar observerades ingen cellrundning. Båda studierna visade att toxin B har en egenskap av proteolytisk klyvning, vilket är avgörande för tillgång till cytosolen. Att ha ett surt endosom-pH leder till topologiska förändringar av TcdB (Figur 6).

GeneticsEdit

genen som kodar för tcdb-proteinet, tcdB, ligger inom den kromosomala regionen på 19,6 kb. Detta är känt som platsen för patogenicitet eller PaLoc (Figur 2). Den öppna läsramen (ORF) för tcdB är 7 098 nukleotider i längd. Det är viktigt att nämna att-förutom de stora toxingenerna i PaLoc-regionen – finns det tre andra tillbehörsgener som kodar i PaLoc-regionen: tcdR (L), tcdC (R) och tcdE i mitten. Dessa gener hjälper till att reglera tcda och tcdb-uttryck. De hjälper också till att utsöndra eller frigöra toxinerna från cellen. Kodningsgenen tcdE, belägen mellan tcdB och tcdA, är analog med holinproteiner, så det föreslås att tcdE fungerar som en facilitatorgen som förbättrar frisättningen eller utsöndringen av TcdA och TcdB följaktligen ökar permeabiliteten hos värdcellmembranet.

Toxin detectionEdit

det finns olika plasmidstorlekar av C. difficile. De detekterade molekylvikterna sträcker sig från 2, 7×106 till 100×106, men plasmidstorlekar visar ingen korrelation med toxicitet. För att detektera toxin B-nivån i C. difficile använder kliniker i stor utsträckning cellodlingsanalyser härledda från avföringsprover från patienter med PMC. Cellodlingsanalysen betraktas som en” guldstandard ” för att detektera toxicitet i C. difficile eftersom en liten mängd toxin B kan orsaka cellrundning (Fig. 4), således är det en stor fördel med kliniska laboratorier att göra korrelationer med CDAD orsakad av TcdB. Även om cytotoxisk aktivitet hos stora clostridiala toxiner (LCT) hittades i PMC-patientavföringsprover, hade toxin B-aktivitet mer skadliga cytotoxiska effekter i jämförelse med toxin A. Därför dämpas aktiviteten av toxin A när den inte isoleras från toxin B. detekteringen av C. difficile-toxicitet är extremt känslig, men med hjälp av cellodlingsanalysen tillåter kliniska laboratorier att övervinna utmaningen; att använda doser så lite som 1 pg/mL toxin B är tillräckligt för att orsaka cellrundning. Detta är den stora fördelen med att använda odlingsvävnadsanalysen för att upptäcka toxicitet hos PMC-patienter. Även om kliniska laboratorier har försökt använda en analys mikrotiterplatta enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) och andra tekniker för att detektera den cytotoxiska aktiviteten hos toxin B i avföring från PMC-patienter, är resultaten inte lika exakta som de där cellodlingsanalyser användes.

produktion factorEdit

genom tillsats av antimikrobiella medel, t. ex. clindamycin, i odlingstillväxtmediet, har studier visat att den cytotoxiska aktiviteten i C. difficile-kulturer ökar med 4-8 gånger. Dessutom, att känna till antibiotikas roll på orsakerna till PMC, fokuserade många tidigare studier på effekterna av antimikrobiella produktion av toxiner. Som ett resultat kunde studier dra slutsatsen att den subinhibitoriska naturen hos vankomycin och penicillinnivåer ökade toxinproduktionen i kulturer av C. difficile. Mängden toxinproduktion korrelerades med användningen av tillväxtmedium för organismerna. En annan studie illustrerade att de höga nivåerna av toxinproduktion av TcdB observerades i komplexa medier såsom hjärninfusionsbuljong. Höga nivåer av toxiner producerades med isolering av mycket virulent. Omvänt producerades låga nivåer av toxiner med isolering av svagt virulent. Således visar det sig att produktionen av toxiner samreglerades. Även om mekanismen bakom miljöns engagemang i att modulera signalerna som uttrycker toxinerna inte förstås, har in vitro-studier visat att uttryck av toxin stärks av katabolit förtryck och stress, t.ex. antibiotika. En annan studie har visat att begränsande biotin i väl karakteriserat medium ökar produktionen av TcdB med 64-faldigt och TcdA med 35-faldigt. Detta gjordes med C. difficile och doser av biotin så små som 0,05 nM. Flera andra tidiga studier har argumenterat mot teorin att produktionen av toxin har något att hantera stress eller katabolit förtryck av antingen toxin TcdA eller TcdB. Många studier säger också att huvudorsaken till skillnaderna bland andra studier beror på toxinproduktion som inte förekommer med alla isolat av C. difficile.