Gall-Esculin Test för presumptiv identifiering av enterokocker och streptokocker: effekter av Gallkoncentration, Inokuleringsteknik och inkubationstid

erkännande och differentiering av katalas-negativa, alfa-hemolytiska och icke-hemolytiska grampositiva kocker i par och kedjor som enterokocker; Grupp D streptokocker (huvudsakligenstreptococcus bovis); och icke-Grupp D viridans grupp streptokocker är kliniskt viktiga (10). Gall-esculin-testet används ofta för att differentiera enterokocker och Grupp D-streptokocker, som är galltoleranta och kan hydrolysera esculin till esculetin, från icke-Grupp D viridans grupp streptokocker, som växer dåligt på gallan. Först beskrivet 1926 av Meyer och Schonfeld (8) visades Galle-esculin-testet av Facklam och Moody (2, 3, 5) för att ha en känslighet på 100% och en specificitet på 97% för att identifiera enterokocker och Grupp D-streptokocker. Dessa resultat erhölls med agar-snedställningar innehållande 4% oxgall (gallsalter), inokulerade med 1 eller 2 droppar av en 24-h Todd-Hewitt både organismkulturen (”nästa dag” inokulering) och inkuberades i 48 h. i rutinmässig diagnostisk bakteriologi är ett sådant protokoll opraktiskt, eftersom det kräver 3 dagar från det att kolonierna detekteras på primära plattor. De flesta läroböcker och procedurhandböcker rekommenderar att man inokulerar agar-lutningar direkt från några kolonier (”samma dag”-inokulering) snarare än från en 24-h-subkultur i buljong, men data som stöder denna icke-standardiserade alternativa teknik saknas.

därför utvärderade vi känsligheten och specificiteten hos gall-esculin-testet med två olika metoder för inokulering samma dag (standardiserad och icke-standardiserad) och två olika inkubationstider (24 och 48 timmar). Vi jämförde också esculin slants innehållande 2 och 4% oxgall i formuleringar som för närvarande finns tillgängliga från två stora kommersiella källor i USA.

katalas-negativa, grampositiva kocker i par och kedjor som bildar alfa-hemolytiska eller icke-hemolytiska kolonier på 5% fårblodsagar som var positiva för PYR (Murex, Dartford, Storbritannien) och växte i tryptisk sojabuljong innehållande 6,5% NaCl (Becton Dickinson Microbiology Systems , Cockeysville, Md.) identifierades som enterokocker; de var specierade med API Rapid Strep-systemet (biom bisexrieux Vitek, Hazelwood, Mo.). Katalas-negativa, grampositiva kocker i par och kedjor som bildade alfa-hemolytiska eller icke-hemolytiska kolonier som var negativa för PYR, växte inte i 6,5% NaCl, var positiva för Grupp D-antigen genom latexagglutination (Murex) och hade ett suggestivt (90% sannolikhet för Sannolikhet) biokemiskt mönster av API Rapid Strep-systemet identifierades som S. bovis. Katalas-negativa, grampositiva kocker i par och kedjor som bildar alfa-hemolytiska eller icke-hemolytiska kolonier som var negativa för PYR och Grupp D-antigen (och var olösliga i gallan om alfa-hemolytisk) kallades viridans grupp streptokocker.

Totalt 110 enterokockstammar (34 Enterococcus faecalis, 15 Enterococcus faecium och 61 icke-hemolytiska och icke-specifierade Stammar), 30 S. bovis-stammar (2 alfa-hemolytiska och 28 icke-hemolytiska stammar) och 110 icke-Grupp D viridans grupp streptokockstammar (83 alfa-hemolytiska och 27 icke-hemolytiska stammar) testades. Stammarna isolerades i följd från blodkulturer utförda vid Duke University Medical Center under en 4-årsperiod, förutom 19 S. bovisstrains som erhölls från Mayo Clinic.

färska (24-h) bakterier inokulerades på tre olika esculin agar-lutningar innehållande antingen ingen galla (BDMS), 2% oxgall (motsvarande 20% galla) (BDMS) eller 4% oxgall (motsvarande 40% galla) (Remel, Lenexa, Kans.). Förutom oxgall var kompositionerna i de tre medierna desamma. För varje medium användes följande två inokuleringstekniker: (i) direkt, icke-standardiserad S-formad inokulering av 1 till 10 kolonier och (ii) indirekt, standardiserad inokulering av 10 oc (kalibrerad slinga) av en 0,5 McFarland standard suspension av bakterier i sterilt avjoniserat vatten. Lutningarna inkuberades vid 35 CCB i omgivande luft (2) med lösa lock för 48 h. avläsningar togs vid 24 och 48 h. en reaktion ansågs positiv när hälften eller mer av mediet var svart (4).

med ett undantag gav alla 110 enterokockstammar tydliga positiva reaktioner efter 24 och 48 timmars inkubation (99% känslighet). Det standardiserade inokulatet (ungefär 106 CFU) var lika känsligt som det tyngre, icke-standardiserade inokulatet. Facklam och Moody, med användning av ett inokulum av 107 till 108 CFU på agar-snedställningar, rapporterade en känslighet av 100% vid 48 h men fann 2 av 76 (5) och 6 av 157 (3) enterokockstammar att vara gall-esculin negativ (98% känslighet) efter 24 h inkubation. Svan (13), med användning av ett icke-standardiserat inokulum beskrivet som tunga såväl som agarplattor på vilka någon svärtning ansågs vara ett positivt resultat, erhöll en känslighet av 100% vid 24 h med 121 enterokockstammar. Men baserat på Facklams publikationer rekommenderar de flesta läroböcker och procedurhandböcker inkubation i 48 timmar innan de rapporterar ett negativt resultat.

alla 30 stammar av S. bovis var positiva vid 24 och 48 h oavsett gallkoncentration eller ympningsmetod (100% känslighet). Facklam (3) rapporterade en känslighet av 94 och 100% vid 24 respektive 48 h med 37 Grupp D streptokockstammar.

Tabell 1 ger procentandelarna av falskt positiva gall-esculintest för 110 icke-Grupp D-viridans grupp streptokockstammar. Vi fann att specificiteten (100% minus procenten falskt positivt) var maximal (97%) med ett standardiserat inokulum strimmat på agar-snedställningar innehållande 4% oxgall och läst efter 24 h. falska positiva erhölls med två Streptococcus millerioch en Streptococcus lactis subsp. diacetylaktissträngar. Brist på standardisering av inokulatet, minskning av koncentrationen av oxgall till 2% och förlängning av inkubationstiden till 48 h ökade antalet falska positiva till högst 24%. I tidigare studier med en selektiv esculinagar innehållande natriumazid och endast 10% Gall var positiva reaktioner med icke-Grupp D viridans grupp streptokocker vanliga (6, 11, 12). Inga uppgifter om användningen av ett medium som innehåller 2% oxgall har publicerats tidigare. Våra resultat tyder på att denna koncentration är suboptimal. Med användning av 4% oxgall fann Swan (13) två galltoleranta viridansgrupps streptokockstammar av 21 isolat; varken stam hydrolyserad esculin vid 24 h. Facklam et al. rapporterade specificiteter på 99% vid 24 timmar (3) och 81 (4) till 97% (3) vid 48 timmar med 4% oxgall.

en slående skillnad hittades när undergrupperna av alfa-hemolytiska och icke-hemolytiska icke-Grupp D viridans grupp streptokocker jämfördes för antalet falska positiva effekter. För Alfa-hemolytiska stammar var detta antal 0% efter 24 h och 3% efter 48 h, medan det för icke-hemolytiska stammar var 11% efter 24 h och 33% efter 48 h, med 4% oxgall och ett standardiserat inokulum (P = 0,017 för 24-h-värden; två-tailed Fishers exakta test). En sådan observation har inte rapporterats tidigare.

för andra prover än blod och normalt sterila platser är ett flödesschema baserat på gall-esculin-testet kombinerat med 6,5% NaCl-tolerans eller närvaro av PYR tillräckligt för tillförlitlig identifiering av enterokocker. Galle-esculin-positiva organismer från blod och normalt sterila platser bör specieras. Speciering av enterokocker är användbar av epidemiologiska skäl och eftersom E. faecium och andra arter tenderar att vara mer resistenta mot antibiotika än E. faecalis (8, 9). En definitiv identifiering ofS. bovis är viktigt, eftersom organismen är associerad med kolonkarcinom, vilket bör uteslutas hos sådana patienter (7). Å andra sidan, falskt positiva rapporter oms. bovis kan leda till onödiga undersökningar. Speciering av gall-esculin-positiva organismer möjliggör också detektering av falskt positiva icke-Grupp D-viridans grupp streptokocker. Terapeutiska fel kan uppstå med felidentifiering av streptokocker och enterokocker (1). Rutinmässig speciering av gall-esculin-negativa organismer är inte nödvändig, eftersom enterokocker och Grupp D-streptokocker sällan ger falska negativa reaktioner.

Sammanfattningsvis fungerar gall-esculin-testet bra för att snabbt separera enterokocker och Grupp D-streptokocker från icke-Grupp D viridans grupp streptokocker till låg kostnad och med god känslighet (>99%) och specificitet (97%), förutsatt att det utförs på agar-snedställningar innehållande 40% gall, gjort med ett standardiserat inokulum (10.