Genetiska Kors

ett genetiskt kors är den målmedvetna parningen av två individer som resulterar i kombinationen av genetiskt material i avkomman. Kors kan utföras i många modellsystem – inklusive växter, jäst, flugor och möss—och kan användas för att dissekera genetiska processer eller skapa organismer med nya egenskaper.

denna video kommer att täcka några av principerna för genetiska kors, undersöka en metod för att utföra kors som kallas tetradanalys och diskutera flera tillämpningar av denna teknik.

låt oss först presentera de grundläggande principerna för arv som gör genetiska kors möjliga.

en organisms fenotyp, eller sammansättning av egenskaper, påverkas av dess genetiska sammansättning eller genotyp. I de flesta sexuellt reproducerande organismer producerar föräldragenerationen haploida könsceller, som har en kopia av varje distinkt kromosom. Dessa smälter sedan under parning för att producera en diploid avkomma med två homologa kopior av varje kromosom. Om båda kromosomerna innehåller samma allel eller variantform av en gen, är organismen ”homozygot” vid det genetiska stället; annars är det ”heterozygot.”

för att börja cykeln på nytt genererar den diploida organismen igen haploida gameter via meios. Under denna process genomgår de två homologa kromosomerna” rekombination”, där bitar av ekvivalenta sekvenser utbyts mellan paret. Denna process blandar upp föräldraallelerna som ärvs av varje avkomma, vilket ökar deras genetiska mångfald.

en av de första människorna som utförde systematiska genetiska kors var ”genetikens Fader”, Gregor Mendel. Genom att använda den lätt manipulerade ärtplantan och undersöka en serie egenskaper med konsekventa arvsmönster kunde Mendel härleda tre grundläggande arvslagar som skulle ligga till grund för genetiken.

Mendels första lag är lagen om enhetlighet, som säger att heterozygoteavkomman till den första eller F1-generationen av två homozygota individer kommer att ha fenotypen av endast en förälder. Allelen som etablerar denna fenotyp kallas ”dominerande”, medan den ”dolda” allelen är ”recessiv.”Vi vet nu att dominansförhållanden ofta är mindre tydliga, med fall som ofullständig dominans, där heterozygoter uttrycker en blandad fenotyp; och kodominans, där båda fenotyperna visas.

lagen om segregering säger att en allel slumpmässigt tilldelas varje gamete. Genom att observera att F2-avkomman från självbefruktningen av heterozygot F1-individer visade en 3:1 fenotypiskt förhållande, men att två av de fenotypiskt dominerande individerna faktiskt är heterozygoter, härledde Mendel att de två föräldraallelerna måste ärvas separat. Idag vet vi att segregering inträffar under meios, när de två homologa kromosomerna hos den diploida föräldern delas slumpmässigt in i haploida dotterceller, var och en ärver en av de två allelerna.

Mendels tredje lag är lagen om oberoende sortiment, som säger att enskilda egenskaper ärvs oberoende. Vi vet nu att absolut oberoende endast existerar för egenskaper som styrs av gener på separata kromosomer i den haploida uppsättningen, som distribueras oberoende till dotterceller under meios. För två gener på samma kromosom är avståndet mellan dem omvänt proportionellt mot sannolikheten för att de rekombineras på olika homologa kromosomer, och i förlängning, hur sannolikt De ärvs tillsammans i samma avkomma. Därför ger analys av de fyra meiotiska produkterna av en diploid organism ett sätt för forskare att kartlägga placeringen av gener.

efter att ha granskat principerna bakom genetiska kors, låt oss ta en titt på ett protokoll för tetradanalys.

denna teknik tillämpas vanligtvis på vissa encelliga alger eller svampar, såsom jäst, för att dissekera de fyra haploida meiotiska produkterna eller sporerna, som i dessa arter förblir tillsammans som en ”tetrad” i en enda cellkropp.

för att utföra tetradanalys i jäst odlas de önskade stammarna först på lämpligt medium. Jästceller från enskilda kolonier får para sig, till exempel genom att strimma varje stam i ett korsmönster på en ny platta. Denna platta replikeras sedan på selektiva medier för att isolera endast korsets diploida produkt.

valda diploida celler odlas på näringsfattiga medier för att inducera sporulering och tetradbildning. Asci, som är de strukturer som håller tetraderna av sporer, smälts i lösningar innehållande enzymet zymolyas. Efter matsmältningen manipuleras individuella asci med hjälp av ett tetrad-dissekerande mikroskop. De arrangeras på specifika platser på en tillväxtplatta och störs för att frigöra de enskilda sporerna. Dessa kan placeras i ett rutnät-liknande mönster, där varje sports skulle generera en enskild koloni som kan analyseras ytterligare.

nu när du vet hur tetradanalys utförs, låt oss undersöka några av de många applikationerna eller modifieringarna av denna teknik.

Manuell dissektion av tetrader är tidskrävande, och forskare har utarbetat alternativ med hög genomströmning, såsom streckkodsaktiverad sekvensering av tetrader. I denna metod transformerades den diploida avkomman från ett jästkors med ett bibliotek av plasmider, som var och en innehåller en kort, unik sekvens känd som en ”streckkod” som fungerar som en identifierare för varje avkomma. Plasmiderna uttrycker också GFP, så att jäst asci kan väljas via flödescytometri och sorteras på agarplattor. Asci lyserades massor på plattorna, och sporerna fick växa till små kolonier. Kolonierna fördelades sedan slumpmässigt till 96-brunnsplattor för genotypning. Den unika sekvensen streckkod tillåter forskare att gruppera de fyra kolonierna som uppstod från sporer från varje tetrad.

genetiska kors kan också användas för att generera jästceller med ett stort antal gendeletioner. I den gröna monsterprocessen paras och sporuleras haploid mutantjäst som bär olika gendeletioner markerade med GFP. Dessa haploida avkommor, av vilka några bär deletioner som ärvts från båda föräldrarna, sorteras via fluorescensaktiverad flödescytometri, där GFP-intensitet visade sig korrelera med antalet deletioner som finns i en viss jäststam. Dessa utvalda celler odlades sedan och korsades igen. Upprepa denna cykel genererade jäststammar innehållande många raderingar.

slutligen har genetiska kors anpassats för användning i många modellsystem, såsom malaria-orsakande intracellulär parasit Plasmodium. Eftersom parasiten bara kan reproducera sig i andra celler måste alla korssteg utföras hos möss eller myggor, parasitens naturliga värd respektive vektor. Här infekterades möss med två unika Plasmodiumstammar vid blodparasitstadiet. Parasiterna överfördes sedan till myggor via blodmatning, och en gång inuti mognade de till gameter som skulle befruktas för att bilda diploida zygoter. De mogna sporozoiterna skördades sedan från myggan och användes för att infektera na-möss, där parasiterna förökades för att isolera korsavkomman av intresse.

du har just tittat på joves video på genetiska kors. I den här videon introducerade vi arvsprinciperna, hur genetiska kors i vissa organismer kan analyseras med tetraddissektion och några aktuella applikationer. Som alltid, tack för att du tittade!