Proteinas K
aktiverat av kalcium smälter enzymet proteiner företrädesvis efter hydrofoba aminosyror (alifatiska, aromatiska och andra hydrofoba aminosyror). Även om kalciumjoner inte påverkar enzymaktiviteten bidrar de till dess stabilitet.Proteiner kommer att smälta fullständigt om inkubationstiden är lång och proteaskoncentrationen tillräckligt hög. Vid avlägsnande av kalciumjonerna reduceras enzymets stabilitet, men den proteolytiska aktiviteten förblir. Proteinas K har två bindningsställen för Ca2+, som ligger nära det aktiva centrumet, men är inte direkt involverade i den katalytiska mekanismen. Den återstående aktiviteten är tillräcklig för att smälta proteiner, som vanligtvis förorenar nukleinsyrapreparat. Därför utförs digestionen med Proteinas K för rening av nukleinsyror vanligen i närvaro av EDTA (inhibering av metalljonberoende enzymer såsom nukleaser).
Proteinas K är också stabilt över ett brett pH-område (4-12), med ett pH-optimalt pH 8,0.En höjning av reaktionstemperaturen från 37 C till 50-60 C kan öka aktiviteten flera gånger, som tillsatsen av 0,5-1% natriumdodecylsulfat (SDS) eller Guanidiniumklorid (3 M), Guanidiniumtiocyanat (1 M) och urea (4 M). De ovan nämnda betingelserna förbättrar proteinas k-aktivitet genom att göra dess substratklyvningsställen mer tillgängliga. Temperaturer över 65 kcal C, triklorättiksyra (TCA) eller serinproteashämmarna AEBSF, PMSF eller DFP hämmar aktiviteten. Proteinas K hämmas inte av Guanidiniumklorid, Guanidiniumtiocyanat, urea, Sarkosyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, citrat, jodättiksyra, EDTA eller av andra serinproteashämmare som Na-Tosyl-Lys Klormetylketon (TLCK) och Na-Tosyl-Phe Klormetylketon (TPCK).
proteas k-aktivitet i vanliga buffertar
| Buffert (pH = 8,0, 50 CCB, 1,25 CCB/mL proteas K, 15 min inkubation) | Proteinas k-aktivitet (%) |
|---|---|
| 30 mM Tris * Cl | 100 |
| 30 mM Tris * Cl; 30 mM EDTA; 5% Tween 20; 0,5% Triton X-100; 800 mM GuHCl | 313 |
| 36 mM Tris * Cl; 36 mM EDTA; 5% Tween 20; 0,36% Triton X-100; 735 mm GuHCl | 301 |
| 10 mM Tris * Cl; 25 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,5% SDS | 128 |
| 10 mM Tris * Cl; 100 mM EDTA; 20 mM NaCl; 1% Sarkosyl | 74 |
| 10 mM Tris * Cl; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,45% Tween 20; 0,5% Triton X-100 | 106 |
| 10 mM Tris * Cl; 100 mm EDTA; 0.5% säkerhetsdatablad | 120 |
| 30 Mm Tris * Cl; 10 mM EDTA; 1% SDS | 203 |