Proteinrening
val av utgångsmaterial är nyckeln till utformningen av en reningsprocess. I en växt eller ett djur distribueras ett visst protein vanligtvis inte homogent i hela kroppen; olika organ eller vävnader har högre eller lägre koncentrationer av proteinet. Användning av endast vävnader eller organ med högsta koncentration minskar de volymer som behövs för att producera en given mängd renat protein. Om proteinet är närvarande i låg överflöd, eller om det har ett högt värde, kan forskare använda rekombinant DNA-teknik för att utveckla celler som kommer att producera stora mängder av det önskade proteinet (detta är känt som ett uttryckssystem). Rekombinant uttryck gör att proteinet kan märkas, t.ex. av en His-tagg eller Strep-tagg för att underlätta rening, vilket minskar antalet reningssteg som krävs.
en analytisk rening använder i allmänhet tre egenskaper för att separera proteiner. Först kan proteiner renas enligt deras isoelektriska punkter genom att köra dem genom en pH-graderad gel eller en jonbytarkolonn. För det andra kan proteiner separeras enligt deras storlek eller molekylvikt via storlek uteslutning kromatografi eller genom SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores) analys. Proteiner renas ofta genom att använda 2D-sida och analyseras sedan med peptidmassavtryck för att fastställa proteinidentiteten. Detta är mycket användbart för vetenskapliga ändamål och detektionsgränserna för protein är numera mycket låga och nanogrammängder protein är tillräckliga för deras analys. För det tredje kan proteiner separeras genom polaritet/hydrofobicitet via högpresterande vätskekromatografi eller omvänd fas kromatografi.
vanligtvis innehåller ett proteinreningsprotokoll ett eller flera kromatografiska steg. Den grundläggande proceduren i kromatografi är att strömma lösningen innehållande proteinet genom en kolonn fylld med olika material. Olika proteiner interagerar annorlunda med kolonnmaterialet och kan således separeras med den tid som krävs för att passera kolonnen eller de villkor som krävs för att eluera proteinet från kolonnen. Vanligtvis detekteras proteiner när de kommer från kolonnen genom deras absorbans vid 280 nm. Det finns många olika kromatografiska metoder:
storlek uteslutning kromatografiedit
kromatografi kan användas för att separera protein i lösning eller denatureringsförhållanden genom att använda porösa geler. Denna teknik är känd som storlek uteslutning kromatografi. Principen är att mindre molekyler måste korsa en större volym i en porös matris. Följaktligen kommer proteiner med ett visst intervall i storlek att kräva en variabel volym eluent (lösningsmedel) innan de samlas i den andra änden av gelkolonnen.
i samband med proteinrening samlas eluenten vanligtvis i olika provrör. Alla provrör som inte innehåller något mätbart spår av proteinet att rena kasseras. Den återstående lösningen är således gjord av proteinet för att rena och alla andra liknande proteiner.
Separation baserad på laddning eller hydrofobicityedit
hydrofob interaktionskromatografiedit
HIC-media är amfifil, med både hydrofoba och hydrofila regioner, vilket möjliggör separation av proteiner baserat på deras ythydrofobicitet. Målproteiner och deras produktaggregat arter tenderar att ha olika hydrofoba egenskaper och avlägsna dem via HIC renar ytterligare proteinet av intresse. Dessutom använder den använda miljön vanligtvis mindre hårda denatureringsförhållanden än andra kromatografitekniker, vilket bidrar till att bevara proteinet av intresse i dess ursprungliga och funktionella tillstånd. I rent vatten skulle interaktionerna mellan hartset och de hydrofoba regionerna av protein vara mycket svaga, men denna interaktion förbättras genom att applicera ett proteinprov på HIC-harts i buffert med hög jonstyrka. Buffertens jonstyrka reduceras sedan till eluerade proteiner i ordning med minskande hydrofobicitet.
Jonbytarkromatografiedit
Jonbytarkromatografi separerar föreningar beroende på naturen och graden av deras jonladdning. Kolumnen som ska användas väljs utifrån dess typ och laddningsstyrka. Anjonbytarhartser har en positiv laddning och används för att behålla och separera negativt laddade föreningar (anjoner), medan katjonbytarhartser har en negativ laddning och används för att separera positivt laddade molekyler (katjoner).
innan separationen börjar pumpas en buffert genom kolonnen för att jämvikta de motstående laddade jonerna. Vid injektion av provet kommer lösta molekyler att utbyta med buffertjonerna när var och en tävlar om bindningsställena på hartset. Längden på retentionen för varje löst ämne beror på styrkan i laddningen. De mest svagt laddade föreningarna eluerar först, följt av de med successivt starkare laddningar. På grund av separationsmekanismens natur spelar pH, bufferttyp, buffertkoncentration och temperatur alla viktiga roller för att styra separationen.
Jonbytarkromatografi är ett mycket kraftfullt verktyg för användning vid proteinrening och används ofta i både analytiska och preparativa separationer.
fritt flöde-elektroforesredigera
Friflödeselektrofores (FFE) är en bärarfri elektroforesteknik som möjliggör preparativ proteinseparation i en laminär buffertström med hjälp av ett ortogonalt elektriskt fält. Genom att använda en pH-gradient, som till exempel kan induceras av amfolyter, tillåter denna teknik att separera proteinisoformer upp till en upplösning av < 0,02 delta-pI.
Affinitetskromatografiredigera
affinitetskromatografi är en separationsteknik baserad på molekylär konformation, som ofta använder applikationsspecifika hartser. Dessa hartser har ligander fästa vid sina ytor som är specifika för föreningarna som ska separeras. Oftast fungerar dessa ligander på ett sätt som liknar antikropp-antigeninteraktioner. Denna” lås och nyckel ” passar mellan liganden och dess målförening gör den mycket specifik och genererar ofta en enda topp, medan allt annat i provet inte hålls kvar.
många membranproteiner är glykoproteiner och kan renas genom lektinaffinitetskromatografi. Detergent-solubiliserade proteiner kan tillåtas binda till ett kromatografiharts som har modifierats för att ha ett kovalent bundet lektin. Proteiner som inte binder till lektinet tvättas bort och sedan specifikt bundna glykoproteiner kan elueras genom att tillsätta en hög koncentration av ett socker som konkurrerar med de bundna glykoproteinerna vid lektinbindningsstället. Vissa lektiner har hög affinitetsbindning till oligosackarider av glykoproteiner som är svåra att konkurrera med sockerarter, och bundna glykoproteiner måste frisättas genom att denaturera lektinet.
Immunoaffinitetskromatografiredigera
Immunoaffinitetskromatografi använder den specifika bindningen av en antikropp-antigen för att selektivt rena målproteinet. Förfarandet innefattar immobilisering av ett protein till ett fast substrat (t.ex. en porös pärla eller ett membran), som sedan selektivt binder målet, medan allt annat flyter igenom. Målproteinet kan elueras genom att ändra pH eller salthalten. Den immobiliserade liganden kan vara en antikropp (såsom Immunoglobulin G) eller det kan vara ett protein (såsom Protein A). Eftersom denna metod inte involverar teknik i en tagg kan den användas för proteiner från naturliga källor.
rening av ett taggat proteinEdit
ett annat sätt att märka proteiner är att konstruera en antigenpeptidmärke på proteinet och sedan rena proteinet på en kolonn eller genom att inkubera med ett löst harts som är belagt med en immobiliserad antikropp. Denna speciella procedur är känd som immunoprecipitation. Immunoprecipitation är ganska kapabel att generera en extremt specifik interaktion som vanligtvis resulterar i att endast det önskade proteinet binds. De renade taggade proteinerna kan sedan lätt separeras från de andra proteinerna i lösning och senare elueras tillbaka till ren lösning.
när taggarna inte behövs längre kan de klyvas av ett proteas. Detta innebär ofta att konstruera en proteas klyvningsplats mellan taggen och proteinet.
HPLCEdit
högpresterande vätskekromatografi eller högtrycksvätskekromatografi är en form av kromatografi som applicerar högt tryck för att driva de lösta ämnena genom kolonnen snabbare. Detta innebär att diffusionen är begränsad och upplösningen förbättras. Den vanligaste formen är” omvänd fas ” HPLC, där kolonnmaterialet är hydrofobt. Proteinerna elueras av en gradient av ökande mängder av ett organiskt lösningsmedel, såsom acetonitril. Proteinerna eluerar enligt deras hydrofobicitet. Efter rening genom HPLC proteinet är i en lösning som endast innehåller flyktiga föreningar, och kan lätt lyofiliseras. HPLC-rening resulterar ofta i denaturering av de renade proteinerna och är således inte tillämpligt på proteiner som inte spontant återföds.