Tyrosinase
8.14.2.2.4 Tyrosinase (EC 1.14.18.1) och catecholoxidas (EC 1.10.3.1)
Tyrosinase, som tillhör en proteinfamilj som har det katalytiska centrumet bildat av dinukleär typ-3-koppar, katalyserar ortohydroxyleringen av monofenol och efterföljande oxidation av den Difenoliska produkten till den resulterande Kinonen.178 en serie reaktioner sker under samtidig reduktion av molekylärt syre till vatten. Kinonprodukten är en reaktiv föregångare för syntes av melaninpigment. Tyrosinas, som finns i grönsaker, frukter och svampar, är ett nyckelenzym i brunningen som uppstår vid blåmärken eller långvarig lagring. Hos däggdjur är enzymet ansvarigt för hudpigmenteringsavvikelser, såsom fläckar och defekter.179 tyrosinas är således ganska betydande inom jordbruk och industri. I kosmetikindustrin är utveckling och screening av potenta hämmare av tyrosinas särskilt attraktiva.
tyrosinas klassificeras i typ-3 kopparproteinfamiljen, liksom katekoloxidas och andningspigmentet hemocyanin. Under den katalytiska reaktionen finns typ-3 kopparcentret för tyrosinas i tre redoxformer.178 deoxiformen(Cu(i)–Cu (I)) är en reducerad art som binder syre för att ge oxiformen(Cu(II)–O22-Cu (II)). I oxy-formen binds molekylärt syre som peroxid i ett sidobryggningsläge för att destabilisera O-O-bindningen och aktivera den. Met-formen(Cu(II)–Cu(II)) antas som en vilande enzymatisk form, där Cu (II) joner normalt överbryggas till en liten ligand, såsom en vattenmolekyl eller hydroxidjon.
Katekoloxidas oxiderar Orto-difenoler till motsvarande kinoner men saknar monooxygenas-eller kresolasaktivitet. Hemocyanin fungerar som en syrebärare i leddjur och blötdjur.
kristallstrukturerna av tyrosinas från Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268 och katekoloxidas från sötpotatisen Ipomoea batatas180 har bestämts. De bekräftar att samordningen av typ-3-kopparstället i tyrosinas och katekoloxidas är mycket lik den som finns i hemocyanin. Detta hade härletts tidigare från likheten mellan spektroskopiska egenskaper och en jämförelse av många tyrosinas-och hemocyanin primära strukturer.181-183 på grundval av proteins biologiska källa kunde sju olika domänorganisationer identifieras. Växtkatekoloxidaser av olika organismer har en sekvensidentitet på cirka 40-60%. Sekvensidentiteten mellan katekoloxidaser och mulluscan-hemocyaniner är cirka 35% över nästan hela sekvensens längd. Däremot är sekvensidentiteten mellan växtkatekoloxidaser och andra typ-3-kopparproteiner från vilken icke-växtkälla som helst begränsad till de två kopparbindande regionerna.
de två kopparbindande regionerna visar högsta bevarande i alla typ-3 kopparproteiner. Speciellt regionen bindande unge är mycket konserverad, medan den CuA-bindande regionen visar mer sekvens variation och har hållits ansvarig för de olika funktionerna av tyrosinas, katekoloxidas, och hemocyanin.
den övergripande strukturen av tyrosinas från S. castaneoglobisporus i komplex med öppen läsram ORF378 visas i figur 23. Tyrosinas tar AUC-spiralformade strukturer med kärnan i enzymet, som bildas av en fyrhelixbunt. Det katalytiska dinukleära kopparcentret placeras i det spiralformiga buntet (figur 23). Var och en av de två kopparjonerna på en aktiv plats koordineras av tre His-rester (figur 24), som härrör från de fyra spiralerna i den nya bunten utom his 54. En kopparjon (betecknad CuA) samordnas av His38, His54 och His63. His38 och His63 ligger i mitten av respektive 2 respektive 3. Den andra kopparjonen (CuB) samordnas av his 190, his 194 och his 216. Resterna his 190 och his 194 är i början och i mitten av 6 respektive, och his 216 är i mitten av 7. Detta dikoppercentrum ligger längst ner i den stora konkaviteten som en förmodad substratbindande ficka, som bildas av de hydrofoba resterna. Förutom den spiralformade strukturen har tyrosinas några få strukturer i form av flera strukturer, som bedöms från ryggradens vridningsvinklar. I dessa bildar endast de n-och C-terminala askorbinsträngarna en arkstruktur.
figur 23. Banddiagram över tyrosinas från Streptomyces castaneoglobisporus i komplex med ORF378 (PDB-kod: 1wx3). Tyrosinas och ORF378 visas i rosa respektive hallon. Kopparjonerna CuA och CuB avbildas som gula sfärer; beredda med PyMOL (WL Delano, Palo Alto, 2003).
figur 24. Met-formen av tyrosinas aktiva centrum från Streptomyces castaneoglobisporus (PDB-kod: 1WX3); beredd med PyMOL (W. L. Delano, Palo Alto, 2003).
även om aminosyrasekvensen av tyrosinas endast har 25,3 och 26, 0% identiteter med I. batatas katekoloxidas180 och odg-domänen för bläckfisken dofleini hemocyanin, 184 respektive, är dess övergripande struktur ganska lik deras. Bland dessa tre proteiner observeras en hög grad av konservering i kärndomänen som består av Bisexuell-bunten. Tyrosinas och hemocyaniner från Panulirus interruputus185 och L. polyphemus66 visar ingen signifikant homologi och ingen likhet i deras strukturer, men de katalytiska kärndomänerna för dessa proteiner är överlägsna.
för tyrosinas från S. castaneoglobisporus kunde fem olika tillstånd av det aktiva stället karakteriseras i kristallstrukturer, nämligen kopparfri form, met form I, met form II, deoxy och oxy. I kristallstrukturer av katekoloxidas från I. batatas har met-och deoxitillstånden såväl som ett inhibitorkomplex belysts. I met-tillståndet(Cu(II), Cu (II)) är de två kopparjonerna på ett avstånd av 2.9 OC, var och en av dem samordnas av tre histidines. De överbryggas av en annan atom, troligen en hydroxidjon, på ett avstånd av cirka 1, 8 kcal från varje koppjon, så att var och en av dem har ett koordinationsnummer på 4 (Se figur 24, som visar samma situation för tyrosinas från S. castaneoglobisporus). I deoxi eller reducerat tillstånd är båda kopparatomerna i +1 oxidationstillstånd. Koppar-kopparavståndet är 4,4 kcal. Koordinationsnumren är 4 för CuA (tre histidinligander och en koordinerande vattenmolekyl) och 3 för CuB (tre histidinligander). Koordinationssfären är förvrängd trigonal pyramidal för CuA och kvadratisk plan för CuB (samordningsplatsen upptagen av överbryggande OH− I met-tillståndet är ledig). I hämmarkomplexet med fenyltiourea (PTU) ökar koppar–kopparavståndet till 4,2 kg med svavelatomen PTU som ersätter hydroxobroen I met-tillståndet. Koordinationssfärerna för de två kopparna förblir likartade med met-Statens, men det finns konformationsförändringar vid de aktiva platsresterna. Den mest signifikanta förändringen är en rotation av den aromatiska ringen av Phe261 (katekoloxidasnumrering).
jämfört med met-tillståndet har de koordinerande resterna endast något olika positioner i reducerat tillstånd, vilket indikerar en ganska styv ficka. Förändringarna i koordinationen är förknippade med rörelser av kopparatomerna i fickan. Hämmarkomplexet visar att Phe261 ligger ovanför den aktiva platsen som en grind, som roterar efter att Hämmaren är bunden. Således verkar åtkomst av substratet till det katalytiska metallcentret styras av denna ’grindrest’.
den katalytiska mekanismen för tyrosinas studerades först i detalj av Solomon et al.178 Solomon föreslog en mekanism för både kresolas-och katekolasaktiviteterna för tyrosinas (figur 25). Denna mekanism föreslår att oxy-tillståndet är utgångspunkten för kresolasaktivitet (inre cirkel). Detta tillstånd är närvarande i vilande form av tyrosinas i en andel av cirka 15% (85% met-tillstånd). Ett monofenolsubstrat binder till oxy-tillståndet och monooxygeneras till o-difenol. Denna difenol binder därefter till kopparcentret för met tyrosinas i ett bidentatbindningsläge som föreslås på basis av en modellförening.188 Oxidation av difenolsubstratet leder till det reducerade tillståndet hos det dinukleära kopparcentret. Reoxidation av det reducerade tillståndet till oxy-tillståndet sker genom attack av dioxygen och stänger den katalytiska cykeln.
figur 25. Mekanism för kresolas – och katekolasaktivitet av tyrosinas och katekoloxidas utvecklades på grundval av ett första förslag från Solomon och coworkers178 och inklusive nyare resultat.186,187 återges från C. Gerdemann, C. Eicken, B. Krebs, Acc. Chem. Res. 2002, 35, 183-191, med tillstånd från American Chemical Society.
mekanismen för katekolasaktivitet (yttre cirkel) börjar från oxy och met-tillstånden. Ett difenolsubstrat binder till met-tillståndet (till exempel) följt av oxidationen av substratet till den första Kinonen och bildandet av enzymets reducerade tillstånd. Bindning av dioxygen leder till oxy-tillståndet, som därefter attackeras av den andra difenolmolekylen. Oxidation till den andra Kinonen bildar met-tillståndet igen och stänger den katalytiska cykeln.
alternativa reaktionsmekanismer inkluderar en radikal mekanism som föreslagits av Kitajima och Morooka189 och en mekanism som involverar en cu(III) intermediär baserad på mätningar av modellföreningar.190 på basis av kristallstrukturen hos katekoloxidas–PTU-hämmarkomplexet föreslogs monodentatbindning av substratet för katekoloxidas.180 en radikal mekanism, som föreslagits för den svaga katekolasaktiviteten som finns i bläckfisk vulgaris hemocyanin,191 är också möjlig för katekoloxidas på grund av det starka strukturella förhållandet mellan katekoloxidas från I. batatas och odg hemocyanin som beskrivits ovan.
den distinkta skillnaden mellan katekoloxidas och tyrosinas har ännu inte förklarats. En fördröjningsfas i tyrosinasens monofenolasaktivitet har hittats och studerats och föreslås vara ett resultat av tillfällig inhibering av tyrosinas met-tillstånd genom överskott av monofenolsubstratet (figur 25).186 Monofenolasaktiviteten ökar när difenolprodukten förskjuter monofenolen från met-tyrosinas och möjliggör fortsättning av den katalytiska cykeln. Katekoloxidas i sin isolerade form är uteslutande närvarande i met-tillståndet och hämmas också av fenol. Det föreslogs därför att brist på oxy-tillståndet är anledningen till att katekoloxidas saknar kresolasaktivitet. Eftersom oxy catecholoxidas inte visar någon monooxygenasaktivitet verkar denna förklaring inte helt tillfredsställande. En annan möjlig orsak är att tillgången till CuA, som har föreslagits vara nödvändig för syresättning av monofenoler,192 blockeras i kristallstrukturen av katekoloxidas från I. batatas.