upprättande av en konkurrerande Bindningsanalys som identifierar de olika egenskaperna hos neutraliserande epitoper av hepatit E-Virus

Abstrakt

syftar till att bekräfta de olika egenskaperna hos genotypspecifika och vanliga neutraliserande epitoper av hepatit E-virus (HEV). Sätt: En konkurrerande bindningsanalys fastställdes med kända genotyp – vanliga neutraliserande monoklonala antikroppar (mAbs) 3G1 och 5g5 samt genotypspecifika neutraliserande mAbs 2B1 och 4C5. HEV ORF2 rekombinant p166W01 härledd från genotyp 1 och p166Chn härledd från genotyp 4 användes som belagda antigener för att bestämma om mAbs känner igen oberoende, liknande eller överlappande epitoper. mAbs producerades, renades och konjugerades med pepparrotperoxidas (HRP). HRP-konjugerad 2B1 kunde reagera endast med p166W01 men inte p166Chn, HRP-konjugerad 4C5 kunde reagera endast med p166Chn men inte p166W01, medan HRP-konjugerad 3G1 och 5g5 kunde reagera både med p166W01 och p166Chn. Således utfördes konkurrerande bindningsanalyser successivt med användning av p166W01 och p166Chn-antigen. Resultat och slutsats: resultaten av konkurrerande bindningsanalyser avslöjade att bindningen av HRP-konjugerad 2B1 till p166W01 inte kunde hämmas av 5G5 eller 3G1. På liknande sätt kunde bindningen av HRP-konjugerad 4C5 till p166Chn inte hämmas av 5G5 eller 3G1. MAbs 5g5 och 3G1 blockerade emellertid varandras bindning till p166W01 och p166Chn, vilket tyder på att vanliga och genotypspecifika neutraliserande mAbs känner igen oberoende epitoper.

Baccarat 2018 S. Karger AG, Basel

Inledning

hepatit E-virus (HEV) är ett NONENVELOPED, positivt sträng RNA-virus som överförs huvudsakligen via den orala vägen och orsakar mänsklig akut hepatit E . HEV-infektion kan leda till skadliga prognoser, till exempel livsfel, svår akut hepatit, kronisk infektion hos organtransplanterade och hos immunsupprimerade patienter och hög dödlighet hos gravida kvinnor . Förutom bekräftad infektion hos människor infekterar hev också djur och kan överföras från djur till människor; förekomsten av hepatit E-infektion i de utvecklade länderna har också ökat avsevärt . Dessa resultat tyder på att HEV utgör ett hot mot folkhälsan över hela världen .

även om en serotyp har erkänts, kan HEV-isolat, härledda från olika områden över hela världen, klassificeras i 4 huvudgenotyper . Hev av genotyper 1 och 2 skiljer sig från genotyper 3 och 4 i deras epidemiologiska, antigena och immunogena egenskaper .

hittills är forskning om antigen epitopkarakterisering huvudsakligen baserad på hev-strukturellt protein för ett in vitro-odlingssystem inte tillgängligt . pORF2 är det huvudsakliga hev-strukturella proteinet som kodas av ORF2, vilket är 1 av 3 överlappande öppna läsramar (ORFs) av virusgenomet . Dominerande immunogena regioner av pORF2 har lokaliserats i C-terminal 2/3-regionen, som var de viktigaste målen för vaccinutveckling .

vår tidigare studie har avslöjat förekomsten av en immunogenicitetsskillnad mellan hepatit E-vaccinet p179 (439-617 aminosyror i ORF2-proteinet) härrörande från genotyp 4 och p239 (Hecolin) härrörande från genotyp 1, skillnaden kan hänföras till närvaron av HEV-genotypspecifika epitop(er) . Monoklonala antikroppar (mAbs) producerade hos möss immuniserade respektive med p166Sar(452-617 aminosyror av ORF2-proteinet) härledda från genotyp 1 och p166Chn härledda från genotyp 4 har använts för att bekräfta närvaron av GE notype-specifik epitop (er). Förutom 2 genotyp-vanliga neutraliserande mAbs, 3G1 och 5g5, 2 genotypspecifika neutraliserande mAbs, 2B1 och 4C5, erhölls också. 2B1 mot p166Sar kunde specifikt binda till genotyper 1 och 2 rekombinanta proteiner och neutraliserade endast genotyper 1 och 2 stammar in vitro; 4c5 mot p166chn immunoreagerade specifikt mot genotyper 3 och 4 rekombinanta proteiner och neutraliserade endast genotyp 3 och 4-stammar, medan 3G1 mot p166Sar och 5G5 mot p166chn kunde binda till genotyper 1-4 rekombinanta proteiner och neutraliserade 4 genotypstammar . För vidare studier av de olika egenskaperna hos genotyp-vanliga och genotypspecifika neutraliserande epitoper av HEV utvecklades en konkurrenskraftig bindningsanalys med mAbs 2B1, 3G1, 4c5 och 5G5 för att bekräfta om epitoper som känns igen av mAbs är oberoende, liknande eller överlappande.

material och metoder

rekombinanta proteiner

rekombinant p166 var ett stympat protein av pORF2, nukleotidsekvenserna härleddes från följande HEV-stammar: W01 (genotyp 1, JX857689) och Kina-9829 (genotyp 4, AY789225). Rekombinanta plasmider konstruerades och uttrycktes i Escherichia coli . De 2 His-märkta P166-proteinerna betecknades som p166W01 respektive p166Chn.

Mab-produktion

totalt 4 neutraliserande mAbs, 2B1, 3G1, 4c5 och 5g5 som beskrivits tidigare, användes för att utveckla en konkurrenskraftig enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA). 2B1 och 3G1 höjdes mot p166Sar; 4C5 och 5g5 höjdes mot p166Chn . Mab: erna producerades genom att injicera 106 hybridomceller i bukhålan hos en BALB/c-mus; ascitesvätska innehållande mab: er skördades efter 7-10 dagar, filtrerades, centrifugerades och lagrades vid -80 kcal C .

rening av mAbs

Mab-ascitesvätskan renades med användning av protein G-sepharoskolonnaffinitetskromatografi (Sigma, Tyskland). Fraktioner innehållande antikropp uppsamlades med användning av den sura elueringsbufferten (0,1 M glycin-HCl, pH 2,8) från det immobiliserade proteinet G och bestämdes sedan vid 280 nm; absorbans vid 280 nm (A280) kan användas för att grovt kvantifiera mAbs. Natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores användes för att bekräfta och kvantifiera de renade fraktionerna med användning av bovint serumalbumin .

koppling av Pepparrotperoxidas till mAbs

renade mAbs dialyserades mot 100 mM karbonat – /bikarbonatbuffert (pH 9.3) vid 4 kcal C över natten . Antikroppar kopplades till pepparrotperoxidas (HRP) enligt tillverkarens instruktioner (KPL). Cirka 1,5 mg HRP blandades med 0,5 mg mAb i 0,5 mL total volym HRP-konjugeringsbuffert genom att försiktigt omröra vid rumstemperatur i 1 h. blandningen lämnades vid rumstemperatur i 15 minuter efter att ha tillsatt 10 occyl av reduktionsmedlet och därefter tillsattes 1 volym destillerad glycerol för lagring och vidare användning.

korsreaktivitet av HRP-konjugerade mAbs till heterologt p166-Antigen

ELISA-metoden tillämpades för att bekräfta korsreaktiviteten hos HRP-konjugerade mAbs med p166W01 och p166Chn-antigen . I korthet belades brunnar av mikroplattor med 100 ng av p166W01 respektive p166Chn-antigenet inkuberades i 2 h vid 37 kcal C. Detta följdes av avlägsnande av belagda antigener; 200 kg fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 0,1% bovint serumalbumin tillsattes i brunnar och sedan inkuberades mikroplattor vid rumstemperatur med mild skakning. Två timmar senare kastades blockeringsbufferten och brunnarna tvättades två gånger med PBS innehållande 0,05% Tween-20 (PBST). Seriella 2-faldiga utspädningar av HRP-konjugerade mAbs som sträcker sig från 1: 400 till 1: 25,600 i 1% kasein PBS tillsattes i motsvarande brunnar, följt av 45 min inkubation vid 37 xnumx C; kasein PBS avlägsnades genom tvättning 5 gånger med PBST. Tetrametylbensidin flytande substrat tillsattes för färgutveckling för inkubation vid 37 kcal C för 10 min. Slutligen lästes den optiska densiteten (OD) för varje brunn vid 450 nm, med en 630 nm referensvåglängd.

bestämning av Antigen-och mAb-titrar

titrarna av antigen och mAbs bestämdes med användning av en ELISA. Initialt framställdes seriella 2-faldiga utspädningar av HRP-konjugerade mAbs som sträcker sig från 1: 400 till 1: 25 600 i 1% kasein PBS och tillsattes sedan till brunnar förbehandlade med seriella utspädningar av p166w01 eller p166Chn-antigen. Följt av en 45-min inkubation vid 37 CCB, avlägsnades obundna mAbs genom tvättning 5 gånger med PBST. Tetrametylbensidin flytande substrat tillsattes för färgutveckling för en 10-min inkubation vid 37 kcal C. Slutligen lästes OD för varje brunn vid 450 nm, med en referensvåglängd på 630 nm, för att bestämma utspädningen som undermättades och gav en OD-avläsning på cirka 1,0 vid 450 nm, med en referensvåglängd på 630 nm.

Konkurrensbindningsanalys

de olika egenskaperna hos vanliga och genotypspecifika neutraliserande epitoper av HEV undersöktes med användning av en parvis konkurrensbindningsanalys etablerad med vanliga och genotypspecifika neutraliserande mAbs . Metoderna liknade de ovan beskrivna procedurerna, förutom att p166W01 respektive p166Chn användes som beläggningsantigen, och blandningar av HRP-konjugerad mAb vid två gånger koncentrationen och en mättad koncentration av okonjugerad mAb tillsattes till de belagda brunnarna. OD mättes vid 450 nm, med en 630 nm referensvåglängd. Den procentuella inhiberingen beräknades med hjälp av formeln: 100 kcal . Konkurrensen bedömdes som positiv om hämningsprocenten var mer än 50%.

resultat

korsreaktivitet av HRP-konjugerade mAbs till heterologa P166-Antigen

ELISA-metoden tillämpades för att utvärdera korsreaktiviteten hos HRP-konjugerade mAbs till p166w01-och p166Chn-antigener. Resultaten avslöjade att HRP-konjugerad 2B1 vid utspädningar från 1: 400 till 1: 25 600 reagerade endast med p166W01, men inte med p166Chn, och HRP-konjugerad 4C5 vid utspädningar från 1: 400 till 1: 25 600 reagerade endast med p166Chn. Däremot reagerade HRP-konjugerade 3G1 och 5g5 vid utspädningar från 1: 400 till 1: 25 600 bra med 2 p166-proteinerna (Fig. 1). Dessa observationer liknade de tidigare fynden, 2b1och 4C5 är genotypspecifika mAbs, medan 3G1 och 5g5 är genotyp-vanliga mAbs .

bestämning av P166w01-Antigen och HRP-konjugerade mAb-titrar för konkurrerande Bindningsanalys

p166w01-antigen användes för att fastställa konkurrerande bindningsanalys av mAbs 2B1, 3G1 och 5G5; de korrekta titrarna av mAbs och antigen bestämdes med användning av ELISA. Som visas i Tabell 1, efter kvadratisk titrering, när utspädningen av p166w01-antigenet var 1: 400, var HRP-konjugerad 2B1 1: 6,400, var medelvärdet OD nära 1,0. Under tiden, som visas i Tabell 2, när utspädningen av antigen var 1: 400, var HRP-konjugerad 5G5 respektive HRP-konjugerad 3G1 1: 6 400 respektive 1: 12 800, och medelvärdet OD var nära 1,0.

bestämning av P166chn-Antigen och HRP-konjugerade Mab-titrar för den konkurrerande Bindningsanalysen

p166Chn-antigen användes för att fastställa den konkurrerande bindningsanalysen av mAbs 4C5, 3G1 och 5g5, de korrekta titrarna av mAbs och antigen bestämdes också med användning av ELISA. Såsom visas i tabell 3, efter kvadratisk titrering, när utspädningen av p166Chn-antigenet var 1: 800, var HRP-konjugerad 4C5 1: 6,400 och medelvärdet OD var nära 1,0. Under tiden, som visas i Tabell 4, när utspädningen av antigenet var 1: 800, var utspädningarna av HRP-konjugerad 5G5 respektive HRP-konjugerad 3G1 1: 6 400 respektive 1: 12 800; medelvärdet OD-värdet var nära 1,0.

hämning av bindning av mAbs till p166W01

resultaten av hämning visas i Tabell 5; bindningen av HRP-konjugerat 2B1 till p166W01-antigen hämmades av okonjugerad 2B1 med 68% hämning. Det fanns ingen signifikant hämning mellan 2B1 med mAbs 5G5 och 3G1 (27 och 30%). Mer fullständig hämning erhölls från heterologa mAbs 3G1 och 5G5, för bindningen av HRP-3G1 till antigen hämmades av 5G5 med 61% hämning, HRP-konjugerad 5G5 till antigen hämmades av 3G1 med 99% hämning. Bindning av HRP – 3G1 och HRP-5G5 till p166W01-antigen hämmades också nästan fullständigt av sig själva (81 och 80% hämning). Dessa resultat tyder på att 3G1 och 5g5 kan dela samma epitop eller överlappande epitop, men 2B1 känner förmodligen igen en annan epitop.

hämning av bindning av mAbs till p166Chn

resultaten av hämning visas i Tabell 5: bindningen av HRP-4c5 till p166Chn hämmades av okonjugerad 4C5 med 69% hämning, det fanns ingen signifikant hämning (25 och 30%) erhållen från de andra 2 okonjugerade mAbs 3G1 och 4c5. En högre hämningshastighet erhölls emellertid från HRP-konjugerad mAbs 3G1 och 5g5-bindning till antigen, inhiberad av okonjugerad 5G5 och 3G1 med 65 och 76% hämning. Bindning av HRP-konjugerad 3G1 och HRP-konjugerad 5G5 till p166Chn-antigen hämmades också nästan av sig själva. Dessa resultat tyder också på att 3G1 och 5g5 kan dela samma epitop eller överlappande epitop, medan 4C5 förmodligen känner igen en annan epitop.

diskussion

sedan den nya svinhev isolerades har anti-HEV-antikroppar rapporterats hos många djur , avslöjade HEV-infektion bland djur och människor, och detta kan överföras från djur till människor . Minskningen av hepatit E-sjuklighet och dödlighet berodde på vaccinförebyggande och effektiv diagnos. Kunskap om epitoper av HEV var avgörande för vaccinberedning och diagnostisk utveckling . Detektionen av specifika antikroppar i serum är en av de viktigaste diagnostiska metoderna, och det finns ett växande antal serologiska analyser för antikroppsdetektering. Analyserna som används för att detektera specifika antikroppar varierar emellertid avsevärt i känslighet . Vissa kommersiella diagnostiska analyser baserade på genotyp 1 eller 2 antigener misslyckas med att detektera serumantikroppar mot genotyper 3 eller 4 isolat . Lite är känt om mekanismerna bakom icke-korrespondensen hos de olika diagnostiska analyserna.

för närvarande är ett in vitro-cellodlingssystem fortfarande otillgängligt för HEV-forskning. Därför har pORF2 innehållande de flesta immunogena ställen använts i stor utsträckning för HEV-immunologisk studie, med en konformationsberoende karaktär . Den strukturella grunden för ett immunogen för att framkalla neutraliserande och skyddande antikroppar är den neutraliserande epitopen, som är huvudmålet för hepatit E-vaccinutveckling . Vi har tidigare rapporterat att P166-proteinet, ett stympat protein av pORF2, kan modellera HEV-neutraliserande epitop(er) och antikroppar som höjs mot p166 kan kor neutralisera olika genotyper av HEV . Dessutom var hepatit E p239-vaccin härrörande från genotyp 1 HEV effektivt i en klinisk fas 3-studie som genomfördes i Jiangsu-provinsen, Kina, där epidemins HEV-isolat är genotyp 4 . Dessa fynd avslöjade vanliga neutraliserande epitop (er) finns inom de olika genotyperna av HEV. Förutom de vanliga neutraliserande epitoperna har genotyp-specifika epitoper också bekräftats existera för Mab-beredning och karakterisering .

för att ytterligare identifiera karakteriseringen av vanliga och genotypspecifika neutraliserande epitoper, etablerades den konkurrerande inhiberingsanalysen med vanliga neutraliserande mAbs, 3G1 och 5g5 och genotypspecifika neutraliserande mAbs, 2B1 och 4c5, för att undersöka konkurrensbindningen till p166W01 eller p166Chn-antigen och för att bestämma om mAbs känner igen oberoende, liknande eller överlappande epitoper.

ursprungligen producerades ascitiska vätskor av mAbs 3G1, 2B1, 5g5 och 4C5, renades och konjugerades med HRP. ELISA-metoden tillämpades för att jämföra den bindande af-finiteten hos HRP-konjugerade mAbs med olika genotyper av HEV p166. Resultaten avslöjade att HRP-conjugat ed 2B1 endast reagerade med genotyp 1 p166W01, men inte p166Chn. På samma sätt reagerade HRP-konjugerad 4C5 endast med p166Chn. Däremot reagerade HRP-konjugerade 3G1 och 5g5 bra mot 2-genotypen p166-proteinerna. Så, konkurrenskraftiga bindningsanalyser är baserade på genotyp 1 och 4 HEV p166-antigenerna. Resultaten av konkurrensbindande analyser är inte överraskande, dvs. att bindningen av 2B1 till p166W01 bara tävlade av sig själv, medan 3G1 och 5g5 kunde tävla varandra om bindningen till p166W01. Dessutom konkurrerades bindningen av 4c5 till p166Chn på samma sätt endast av sig själv, men 3G1 och 5g5 kunde tävla varandra om bindningen till p166Chn. Dessa resultat indikerade att 3G1 och 5g5 känner igen samma eller överlappande epitoper och att 2B1 och 4C5 känner igen olika.

Detta är den första studien som undersöker de olika egenskaperna hos genotyp-vanliga och genotypspecifika konformationsneutraliserande epitoper av HEV. Vi visade att vanliga och genotypspecifika neutraliserande epitoper kan vara oberoende. Denna upptäckt är mycket fördelaktig för att demonstrera mekanismerna bakom den låga överensstämmelsen hos de olika diagnostiska analyserna. Ytterligare studier är av avgörande betydelse för att belysa de olika egenskaperna hos neutraliserande epitoper av HEV i effektiviteten av diagnostisk utveckling och vaccinberedning.

bekräftelse

detta arbete stöddes av doctoral scientific research foundation of Anhui Medical University (No.0110037101).

Disclosure Statement

författarna förklarar inga intressekonflikter.

författare kontakter

artikel – / Publikationsdetaljer

Copyright / drog dosering / Disclaimer

Copyright: Alla rättigheter förbehållna. Ingen del av denna publikation får översättas till andra språk, reproduceras eller användas i någon form eller på något sätt, elektroniskt eller mekaniskt, inklusive fotokopiering, inspelning, mikrokopiering eller genom något informationslagrings-och hämtningssystem, utan skriftligt tillstånd från utgivaren.
läkemedelsdosering: författarna och utgivaren har utövat allt för att säkerställa att läkemedelsval och dosering som anges i denna text överensstämmer med nuvarande rekommendationer och praxis vid tidpunkten för publiceringen. Med tanke på pågående forskning, förändringar i statliga föreskrifter och det ständiga flödet av information om läkemedelsbehandling och läkemedelsreaktioner uppmanas läsaren att kontrollera bipacksedeln för varje läkemedel för eventuella förändringar i indikationer och doser och för extra varningar och försiktighetsåtgärder. Detta är särskilt viktigt när det rekommenderade medlet är ett nytt och/eller sällan använt läkemedel.
ansvarsfriskrivning: uttalandena, åsikterna och uppgifterna i denna publikation är enbart de enskilda författarna och bidragsgivarna och inte förläggarna och redaktörerna. Utseendet på annonser eller / och produktreferenser i publikationen är inte en garanti, godkännande eller godkännande av de produkter eller tjänster som annonseras eller av deras effektivitet, kvalitet eller säkerhet. Utgivaren och redaktören frånsäger sig ansvaret för eventuella skador på personer eller egendom till följd av ideer, metoder, instruktioner eller produkter som avses i innehållet eller annonserna.