Vad är Southern Blotting?

av Hannah Simmons, M. Sc.Recenserad av Kate Anderton, B.Sc. (redaktör)

Blotting är den process genom vilken DNA, RNA eller proteiner överförs till ett membran för att visualiseras.

kredit: Paul Cowan/. com

den första av dessa metoder var Southern Blotting, utvecklad 1975 av Edward Southern, och används för att detektera sekvensen av DNA-fragment. Sedan dess har två andra metoder utvecklats, kallad Northern och Western blotting. Dessa är processer som används för att identifiera RNA respektive proteinsekvenser.

Metodik för Southern blotting

DNA-fragment genereras initialt med restriktionsenzymer och separeras av storlek i en process som kallas gelelektrofores. Alkalisk används sedan för att denaturera det dubbelsträngade DNA, som bildar enstaka strängar. DNA överförs sedan till ett nitrocellulosa-eller nylonark genom att placera ett membran över gelen och använda buffertflödet för att uppmuntra DNA-rörelsen från gelen till membranet.

Kapillärflöde och vakuumöverföring är de två vanligaste metoderna som används för att överföra DNA-fragmenten. Vid kapillärflöde placeras gelen över buffertnivån på ett stödblock med ett membran placerat ovanpå. En stapel absorberande handdukar placeras sedan över membranet och används för att absorbera bufferten under gelen och lyfter DNA-fragmenten upp på membranet.

med vakuumöverföring placeras membranet under gelen och båda är nedsänkta i buffert. Ett vakuum används sedan för att skapa ett flöde som drar DNA-fragmenten ner på membranet.

uppvärmning eller UV-strålning används sedan för att säkerställa att DNA-fragmenten förblir fästa vid membranet permanent, samtidigt som det specifika arrangemanget av DNA bibehålls. Enkelsträngade märkta sonder används sedan för att binda till målsekvenser.

arket inkuberas med dessa sonder och endast de komplementära sonderna binder. De icke-komplementära sonderna tvättas sedan från membranet, vilket säkerställer att endast de bundna sonderna förblir. Dessa sonder kan sedan detekteras genom autoradiografi för att avslöja hybridiseringsmönstret på en röntgenfilm.

tillämpningar av Southern blotting

Southern blotting har många olika användningsområden. För det första kan genarrangemang analyseras. Till exempel i immunologi kan denna metod användas för att identifiera klonala omarrangemang av T-cellreceptorgener. För det andra kan specifika fragment av DNA identifieras från en blandning av många andra fragment.

andra exempel på användningar inkluderar både restriktionsfragmentlängdspolymorfism (RFLP) och variabel tandemrepetition (VNTR) analys. RFLP använder skillnaderna i längd i homologa DNA-sekvenser för att kartlägga genom och kan användas i kriminaltekniska och faderskapstester.

VNTR-analys använder skillnaderna i längd av upprepade nukleotidsekvenser för att bilda ett DNA-fingeravtryck, en metod som vanligtvis används vid faderskap och rättsmedicinsk testning.

dessa metoder kan också användas vid diagnos av sjukdom orsakad av mutation, till exempel sicklecellanemi. Detta genetiska tillstånd beror på en enda nukleotidpolymorfism (A till T) i beta-globingenen, vilket resulterar i onormalt hemoglobin.

Southern blotting för bräckligt X-syndrom

Southern blots har använts i stor utsträckning för att identifiera gener med förstärkta upprepade regioner. Dessa är korta, repetitiva sekvenser i DNA som inte kodar för genprodukter. Ett exempel där södra blotting kan vara användbart är vid diagnos av bräckligt X-syndrom. Detta genetiska tillstånd beror på ökningen i CGG/CCG-upprepningsregionen som ligger inom FMR1-genen.

denna gen innehåller vanligtvis mellan 5-40 upprepade regioner. Individer med 55-200 upprepningar har en FMR1-genpremutation, och individer med >200 upprepningar har bräckligt X-syndrom. Ökningen i upprepningar leder till metylering av genen, som hämmar transkription och förhindrar produktion av FMRP-proteinet. Detta protein krävs för nervsystemets normala funktion, därför leder förlust av proteinfunktion till symtomen på bräckligt X-syndrom.

vid diagnos används metyleringskänsligt restriktionsenzym EclX1 och Metyleringskänsligt enzym EcoR1 för att möjliggöra differentiering av metylerade alleler och icke-metylerade alleler. Metylerade alleler skärs endast en gång för att ge ett singulärt DNA-fragment på 5,1 kb.

emellertid skärs icke-metylerade alleler två gånger, vilket ger ett fragment av 2,8 kb. Icke-metylerade premutationsupprepningar (< 200) kan därför särskiljas från metylerade mutationsupprepningar på cirka 200 upprepningar långa, eftersom södra blotting kan användas för att identifiera storleken på DNA-fragmenten.

framtidsperspektiv

Sammantaget är Southern blotting en viktig metod vid diagnos och studie av sjukdom (såsom bräckligt X-syndrom och sicklecellanemi) och analys av DNA av andra skäl (såsom kriminalteknisk och faderskapstestning).

southern blotting är dock mycket tekniskt komplex, dyr, mödosam och kräver en stor mängd DNA-prov. Nya metoder ersätter därför långsamt southern blotting, till exempel PCR i realtid. Denna process är mycket enklare och snabbare än southern blotting och kräver bara en mycket liten volym DNA.

Vidare läsning

• allt Genetikinnehåll
• Vad är genetik?
• Genetikhistoria
• genetik och genuttryck
• genetisk förändring

skriven av

Hannah Simmons

Hannah är en medicinsk och biovetenskap författare med en Master of Science (M.Sc.) examen från Lancaster University, Storbritannien. Innan han blev författare fokuserade Hannahs forskning på upptäckten av biomarkörer för Alzheimers och Parkinsons sjukdom. Hon arbetade också för att ytterligare belysa de biologiska vägarna som är involverade i dessa sjukdomar. Utanför sitt arbete, Hannah tycker om att simma, ta sin hund på en promenad och resa världen.

citat