Tyrosinase
8.14.2.2.4 Tyrosinase (EC 1.14.18.1) og katekoloksidase (EC 1.10.3.1)
Tyrosinase, som tilhører en proteinfamilie med det katalytiske center dannet af dinuclear type-3 kobber, katalyserer orthohydroksyleringen af det Diphenoliske produkt til den resulterende Kinon.178 en række reaktioner forekommer under den samtidige reduktion af molekylært ilt til vand. Kinonproduktet er en reaktiv forløber for syntesen af melaninpigmenter. Tyrosinase, som er indeholdt i grøntsager, frugter og svampe, er et vigtigt middel til bruning, der opstår ved blå mærker eller langtidsopbevaring. Hos pattedyr er det ansvarlig for abnormiteter i hudpigmentering, såsom pletter og defekter.179 tyrosinase er således ret signifikant inden for landbrug og industri. I kosmetikindustrien er udviklingen og screeningen af potente inhibitorer af tyrosinase særligt attraktive.
Tyrosinase klassificeres i type-3-kobberproteinfamilien, ligesom katekoloksidase og åndedrætspigmentet hæmocyanin. Under den katalytiske reaktion findes tyrosinasens type-3 kobbercenter i tre redoksformer.178 deoksiformen(Cu(I)–Cu(I)) er en reduceret art, der binder ilt for at give oksyformen (Cu(II) – O22–Cu(II)). I okseform, molekylært ilt er bundet som overilte i en kurr-kurr2:kurr2 side-on brotilstand, som destabiliserer O–O-bindingen og aktiverer den. Met-formen(Cu(II)–Cu(II)) antages som en hvilende form, hvor cu (II) ioner normalt Broes til en lille ligand, såsom et vandmolekyle eller hydroksidion.
katekoloksidase ilter orthodiphenoler til de tilsvarende kinoner, men mangler monooksygenase-eller cresolaseaktivitet. Hemocyanin fungerer som en iltbærer i leddyr og bløddyr.
krystalstrukturen af tyrosinase fra Streptomyces castaneoglobisporus HUT 620268 og katekoloksidase fra den søde kartoffel Ipomoea batatas180 er blevet bestemt. De bekræfter, at koordineringen af type 3-kobberstedet i tyrosinase og katekoloksidase ligner meget det, der findes i hæmocyanin. Dette var blevet udledt før fra ligheden mellem spektroskopiske egenskaber og en sammenligning af mange primære tyrosinase-og hæmocyaninstrukturer.181-183 på grundlag af den biologiske kilde til proteinerne kunne syv forskellige domæneorganisationer identificeres. Plantekatekoloksidaser af forskellige organismer har en sekvensidentitet på omkring 40-60%. Sekvensidentiteten mellem katekoloksidaser og mulluscan hæmocyaniner er omkring 35% over næsten hele længden af sekvenserne. I modsætning hertil er sekvensidentiteten mellem plantekatekoloksidaser og andre type 3-kobberproteiner fra enhver ikke-plantekilde begrænset til de to kobberbindende regioner.
de to kobberbindende regioner viser den højeste bevaring i alle type-3 kobberproteiner. Især regionen bindende CuB er stærkt konserveret, hvorimod CuA-bindende region viser mere sekvens sort og er blevet holdt ansvarlig for de forskellige funktioner af tyrosinase, katekoloksidase, og hæmocyanin.
den samlede struktur af tyrosinase fra S. castaneoglobisporus i kompleks med åben læseramme ELLERF378 vises i figur 23. Tyrosinase tager en kur-spiralformet struktur med kernen, som er dannet af en fire-spiralbundt. Det katalytiske dinukleære kobbercenter er anbragt i det spiralformede bundt (figur 23). Hver af de to kobberioner på et aktivt sted koordineres af tre his-rester (figur 24), som er afledt af de fire helices af kurr-bundtet undtagen his54. En kobberion (udpeget CuA) koordineres af His38, His54og His63. His38 og his63 er placeret i midten af henholdsvis kr2 og kr3. Den anden kobberion (CuB) koordineres af His190, His194og His216. Resterne His190 og His194 er henholdsvis i begyndelsen og i midten af his216, og his216 er i midten af his7. Dette dicopper-center er placeret i bunden af den store konkavitet som en formodet substratbindende lomme, der dannes af de hydrofobe rester. Ud over den spiralformede struktur, tyrosinase har et par larr-strukturer, som bedømt ud fra rygradens torsionsvinkler. I disse udgør kun de N – og C-terminale kolostrenger en arkstruktur.
figur 23. Ribbon diagram af tyrosinase fra Streptomyces castaneoglobisporus i kompleks med ORF378 (PDB-kode: 1vh3). Tyrosinase og ORF378 er vist i henholdsvis pink og hindbær. Kobberionerne CuA og CuB er afbildet som gule kugler; forberedt med PyMOL (V. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
figur 24. Met-formen af det aktive center af tyrosinase fra Streptomyces castaneoglobisporus (FBF-kode: 1H3); fremstillet med PyMOL (V. L. DeLano, Palo Alto, 2003).
selvom aminosyresekvensen af tyrosinase kun har 25,3 og 26,0% identiteter med dem fra I. batatas catecholoksidase180 og odg-domænet for henholdsvis Octopus dofleini hemocyanin,184, er dens samlede struktur meget lig deres. Blandt disse tre proteiner observeres en høj grad af bevaring i kernedomænet sammensat af kursbundtet. Tyrosinase og hæmocyaniner fra Panulirus interruputus185 og L. polyphemus66 viser ingen signifikant homologi og ingen lighed i deres strukturer, men de katalytiske kernedomæner af disse proteiner er overlejrede.
for tyrosinase fra S. castaneoglobisporus fem forskellige tilstande af det aktive sted kunne karakteriseres i krystalstrukturer, nemlig kobberfri form, met form I, met form II, deoksi og oksi. I krystalstrukturer af katekoloksidase fra I. batatas er met-og deoksistilstandene såvel som et inhibitorkompleks blevet belyst. I met-tilstand (Cu (II), Cu(II)) er de to cupriske ioner i en afstand af 2.9 Og hver af dem koordineres af tre histidiner. De er broet af et andet atom, sandsynligvis en hydroksidion, i en afstand på omkring 1,8 liter fra hver cupric ion, således at hver af dem har et koordinationsnummer på 4 (Se figur 24, som viser den samme situation for tyrosinase fra S. castaneoglobisporus). Begge kobberatomer er i oksi-eller reduceret tilstand i +1 oksid-tilstand. Kobber-kobber afstanden er 4,4 liter. Koordinationsnumrene er 4 for CuA (tre histidinligander og et koordinerende vandmolekyle) og 3 for CuB (tre histidinligander). Koordinationssfæren er forvrænget trigonal pyramidal for CuA og firkantet plan for CuB (koordinationsstedet besat af broen OH− I met-tilstand er ledigt). I inhibitorkomplekset med phenylthiourinstof (PTU) øges kobber–kobberafstanden til 4,2 liter med svovlatomet i PTU, der erstatter hydrokso-broen i met-tilstanden. Koordineringssfærerne for de to kobber forbliver de samme som I met-staten, men der er konformationsændringer på de aktive stedrester. Den væsentligste ændring er en rotation af den aromatiske ring af Phe261 (katekoloksidase nummerering).
sammenlignet med met-tilstanden har de koordinerende rester kun lidt forskellige positioner i reduceret tilstand, hvilket indikerer en ret stiv lomme. Ændringerne i koordinering er forbundet med bevægelser af kobberatomer i lommen. Inhibitorkomplekset viser, at Phe261 er placeret over det aktive sted som en port, der roterer, efter at inhibitoren er bundet. Således synes adgangen til substratet til det katalytiske metalcenter at være styret af denne ‘portrester’.
den katalytiske mekanisme af tyrosinase blev først undersøgt i detaljer af Solomon et al.178 Solomon foreslog en mekanisme for både cresolase og catecholase aktiviteter af tyrosinase (figur 25). Denne mekanisme antyder, at oksytilstanden er udgangspunktet for cresolaseaktivitet (indre cirkel). Denne tilstand er til stede i den hvilende form af tyrosinase i en andel på omkring 15% (85% met tilstand). Et monofenolsubstrat binder sig til oksytilstanden og monooksygeneres til o-diphenol. Denne diphenol binder efterfølgende til kobbercentret af met tyrosinase i en bidentatbindingstilstand foreslået på basis af en modelforbindelse.188 iltning af diphenolsubstratet fører til den reducerede tilstand af det dinukleære kobbercenter. Reoksidering af den reducerede tilstand til oksytilstanden sker ved angreb af dioksygen og lukker den katalytiske cyklus.
figur 25. Mekanisme for cresolase og katekolaseaktivitet af tyrosinase og katekoloksidase udviklet på grundlag af et indledende forslag fra Solomon og kolleger178 og med nyere resultater.186.187 gengivet fra C. Gerdemann; C. Eicken; B. Krebs, Acc. Chem. Res. 2002, 35, 183-191, med tilladelse fra American Chemical Society.
mekanismen for katekolaseaktivitet (ydre cirkel) starter fra oksy og met-tilstande. Et diphenolsubstrat binder til met-tilstanden (for eksempel), efterfulgt af iltning af substratet til den første kinon og dannelsen af den reducerede tilstand af f.eks. Binding af dioksygen fører til oksytilstanden, som efterfølgende angribes af det andet diphenolmolekyle. Iltning til den anden kinon danner met-tilstanden igen og lukker den katalytiske cyklus.
Alternative reaktionsmekanismer inkluderer en radikal mekanisme foreslået af Kitajima og Morooka189 og en mekanisme, der involverer et cu(III) mellemprodukt baseret på målinger af modelforbindelser.190 på basis af krystalstrukturen af katekoloksidase–PTU-hæmmerkomplekset blev monodentatbinding af substratet foreslået for katekoloksidase.180 en radikal mekanisme, som foreslået for den svage katekolaseaktivitet, der findes i Octopus vulgaris hemocyanin,191 er også mulig for katekoloksidase på grund af det stærke strukturelle forhold mellem katekoloksidase fra I. batatas og odg-hæmocyanin som beskrevet ovenfor.
den tydelige forskel mellem katekoloksidase og tyrosinase er endnu ikke blevet forklaret. En lagfase i tyrosinasens monofenolaseaktivitet er blevet fundet og undersøgt og foreslås at være et resultat af midlertidig inhibering af tyrosinasens met-tilstand ved overskud af monofenolsubstratet (figur 25).186 Monofenolaseaktiviteten øges, når diphenolproduktet fortrænger monofenol fra met tyrosinase og tillader fortsættelse af den katalytiske cyklus. Katekoloksidase i sin isolerede form er udelukkende til stede i met-tilstand og hæmmes også af phenol. Det blev derfor antydet, at mangel på oksytilstand er årsagen til, at katekoloksidase mangler cresolaseaktivitet. Da katekoloksidase heller ikke viser nogen monooksygenaseaktivitet, synes denne forklaring ikke helt tilfredsstillende. En anden mulig årsag er, at adgang til CuA,som er blevet foreslået at være nødvendig for iltning af monofenoler, 192 er blokeret i krystalstrukturen af katekoloksidase fra I. batatas.