Obnovitelné syntéza n-butyraldehyd z glukózy inženýrství Escherichia coli

Výběr CoA-acylating aldehyd dehydrogenázy pro n-butyraldehyd výroby

n-Butyraldehyd je meziprodukt při Clostridium CoA-dependentní n-butanol způsobu výroby (Obr. 1b). Bifunkční aldehyd / alkoholdehydrogenáza AdhE2 však katalyzuje přímou dvoustupňovou konverzi butyryl-CoA na n-butanol a obchází n-butyraldehyd jako produkt. Aby se zabránilo konverze n-butyraldehyd do n-butanolu, jsme první nahrazuje AdhE2 s CoA-acylating aldehyd dehydrogenázy (Aldh), katalyzující pouze konverze z butyryl-CoA na n-butyraldehyd. Některé klostridie, jako je Clostridium beijerinckii, obsahují individuální Aldh a Adh místo bifunkčního enzymu pro produkci butanolu. Alternativně se Aldh nachází v degradačních drahách pro ethanolamin a 1,3-propandiol . Nicméně, Aldh z ethanolaminu a 1,3-propandiol využití operons nejsou specifické pro butyryl-CoA snížení a již dříve prokázáno, že produkovat ethanol, pokud jsou vyjádřeny v E. coli . Proto jsme se pro tuto studii rozhodli pracovat s Clostridium Aldh. Na základě sekvence aldh z C. beijerinckii , vybrali jsme další dva homology z C. saccharolyticum a C. saccharoperbutylacetonicum, stejně jako mutant aldh z C. beijerinckii, které jsme dříve izolované v naší laboratoři (viz Další soubor 1 pro jeho pořadí). Tyto čtyři ALDH geny byly jednotlivě klonovány do syntetických operonů s geny nezbytnými k přeměně acetyl-CoA na butyryl-CoA (obr. 1b). Tyto syntetické operons byli vyhnáni rodilými E. coli propagátorem ack a dodržov geny, Balení a PadhE, respektive, které byly již dříve prokázáno, že produkovat vyšší titry butanolu ve srovnání s pomocí IPTG indukovatelných PLlacO1 pořadatel . Zde byly balení a PadhE definovány tak, aby zahrnovaly ribozomální vazebné místo a 5 ‚ nepřeloženou oblast před jejich odpovídajícími geny. atoB, aldh, crt a hbd byly klonovány jako jeden operon na plazmid colE1 původu pod kontrolou Pack. ter a fdh byly jednotlivě exprimovány na plazmidech původu colA a pSC101 pod kontrolou PadhE . Tyto plasmidy byly transformovány do E. coli kmen JCL299, které bylo již dříve prokázáno, že efektivně produkovat n-butanolu a má ldhA, dodržov, frdBC, a pta vyrazil . Po vyřazení smíšených kyselých fermentačních cest JCL299 účinně kanály acetyl-CoA a NADH pro syntézu n-butyraldehydu. Jak se očekávalo, v důsledku přítomnosti endogenních alkoholdehydrogenáz vykazovaly výsledné kmeny minimální produkci n-butyraldehydu (obr. 2a). Většina fermentačních produktů byla n-butanol napříč kmeny exprimujícími čtyři různé geny aldh. Chromozomální yqhD, kódování pro NADPH-dependentní alkohol dehydrogenázy, je známo, že snížení aldehydy na jejich odpovídající alkoholy a vysoce aktivní jako detoxikační mechanismus . Proto jsme vyřadili yqhD v JCL299, čímž jsme získali kmen ELeco1. Při exprimaci dráhy n-butyraldehydu v kmeni ELeco1 byla pozorována produkce n-butyraldehydu. Nejlepší kmen ELeco1 / pKU48 / pRW18 / pRW22 vyprodukoval 0,16 g / L n-butyraldehydu (obr. 2b). Poměr aldehydu k alkoholu byl však 0,39. Tento nízký poměr aldehyd-alkohol indikuje přítomnost jiného aktivního nativního Adh schopného redukovat n-butyraldehyd.

Zlepšení aldehyd-k-poměr alkoholu tím, že dorazí nativní alkohol dehydrogenázy

snížení n-butanol formace a zvýšit aldehyd-k-poměr alkoholu, jsme vyřadili geny kódující další nativní Adh. Na základě předchozí práce pro isobutyraldehyde výroby , jsme se zrušuje osm adh geny, které by mohly přispět k n-butyraldehyd snížení: yjgB, fucO, eutG, ybbO, adhP, gldA, yahK, a yghA. Tyto geny byly vybrány, protože jejich knockouty vedly k vyšším produkčním titrům isobutyraldehydu. Postupně jsme vyřadili každý z těchto genů adh pomocí transdukce fágu P1 s kolekcí Keio. Protože se ukázalo, že všechny tyto geny adh jsou účinné pro zvýšení produkce isobutyraldehydu, byly vyřazeny bez specifického pořadí. Výsledky titrů produkce n-butyraldehydu a poměr aldehydu k alkoholu z těchto mutantních kmenů jsou znázorněny na obr. 3. Všimli jsme si, že titry dosahované ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22 jsou srovnatelné s těmi dosaženo tím, zveřejněné patentové přihlášky od Stojanu Biotechnologií , které používá kmen s identickým genotypem. Protože však titry n-butanolu nebyly ve své práci hlášeny, nelze poměry butyraldehydu a butanolu srovnávat. Zde jsme však posunuli návrh kmene dále a ukázali, že další knockouty nativních genů adh vedly k významnému snížení butanolu. Konečné napětí KS8/pKU48/pRW18/pRW22 dosáhl aldehyd-k-alkoholu poměr 3.1, což představuje osmkrát zlepšení oproti kmen ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22. Zde jsme zaznamenali, že kmen KS7 nesoucí stejné plazmidy dosáhl mírně vyššího poměru aldehydu k alkoholu 3,4. Rozdíl v poměrech aldehyd-alkohol byl však v rozmezí chyb a nevýznamný. Proto byl kmen KS8 použit pro navazující experimenty. Mezi osmi dalšími adh, které jsme vyřadili, eutg, ybbO a yghA nevykazovaly žádný účinek na zvýšení poměru aldehyd-alkohol. Všechny ostatní adh knock out pozitivně přispěly ke zvýšení aldehyd-k-poměr alkoholu, s uvedením jejich rodného výraz a odpovídající enzymy se schopností snížit n-butyraldehyd. Zatímco poměr aldehydu k alkoholu se zvyšoval s každým vyřazením genu adh, titr n-butyraldehydu se významně nezvýšil. Odpovídajícím způsobem se také snížila spotřeba glukózy kmeny s každým dalším vyřazením genu adh (obr. 3). Tyto výsledky naznačují, že tok uhlíku byl snížen. Rozbor termodynamiky každý krok ukázal, že butyryl-CoA snížení n-butyraldehyd je termodynamicky nepříznivý s ΔG’° o 7,7 kJ/mol (vypočteno pomocí eQuilibrator ), což může vést k neefektivní přeměny butyryl-CoA na n-butyraldehyd, zvláště po n-butyraldehyd koncentrace dosáhne určité prahové hodnoty. Je pravděpodobné, že při zpomalení produkce n-butyraldehydu se metabolismus glukózy také zpomaluje kvůli neschopnosti recyklace NADH. Od rodáka e. coli kvašení geny (dodržov, frdBC, a ldhA) byly vyřazeny v napětí KS8, n-butyraldehyd produkce se stává pouze fermentativní dráhy k dispozici recyklovat NADH + h + zpět na NAD+. Při zpomalení biosyntézy n-butyraldehydu je k dispozici méně NAD+ pro použití při glykolýze. Výsledkem je snížení spotřeby glukózy. Proto jsme dále zkoumali účinek odstranění in situ na titr produkce n-butyraldehydu.

Zlepšení n-butyraldehyd titr in situ produktu odstranění

Tady jsme se rozhodli používat in situ kapalina–kapalina, extrakce n-butyraldehyd odstraňování pomocí organických překrytí. Dodekan a oleylalkohol byly vybrány jako extrakční látky kvůli jejich obecné aplikaci a netoxicitě pro mikrobiální kultury . Zjistili jsme, že rozdělovací koeficient n-butyraldehyd ve vodě a dvě organická rozpouštědla měřením poměru n-butyraldehyd objevují v obou vodné a organické fáze (Další soubor 1: Obrázek S2) po intenzivní míchání následuje stacionární inkubace při 37 °C. určena rozdělovací koeficient n-butyraldehyd byl 0.141 a 0.764 pro dodecane a oleoylových alkoholu, respektive. Tento výsledek naznačil, že oleoylových alkoholu může být více vhodné extrakční činidlo pro n-butyraldehyd jako vyšší rozdělovací koeficient indikuje vyšší poměr n-butyraldehyd nalézt v organické vrstvě. Tyto dvě extrakční jsou jen mírně toxické pro E. coli jako růst n-butyraldehyd produkující kmen kultivován v přítomnosti buď dodecane nebo oleoylových alkoholu byly jen mírně snížila ve srovnání s kontrolou bez jakéhokoli extraktu (Obr. 4a), označující vhodnost těchto rozpouštědel pro extrakci in situ. Jak je znázorněno na obr. 4B, titr n-butyraldehydu se významně zlepšil v přítomnosti extrakčního činidla. Konzistentně pro dodekan i oleylalkohol, použití 1 objemu extrakčního činidla překonává objem 0,5. Nejlepším stavu pomocí oleoylových alkoholu s 1:1 extrakční činidlo-k-kultura poměr objemu vyrobené více než 0,6 g/L n-butyraldehyd, což představuje téměř trojnásobné zlepšení oproti ne extraktu. Jak se očekávalo, oleylalkohol překonal dodekan jako extrakční činidlo pro n-butyraldehyd (obr. 4c), v souladu s rozdělovacími koeficienty.

Vliv na snížení média složitost na n-butyraldehyd výroby

dále jsme hodnotili vliv kvasničného extraktu a kultivací na trypton koncentrace na n-butyraldehyd výroby. Použití skvělého vývaru (TB) není obvykle komerčně životaschopné kvůli jeho nákladným nákladům. Kromě toho jsou aldehydy reaktivní a mohou spontánně tvořit Schiffovu bázi s aminy. Od TB obsahuje vysoké množství kvasničného extraktu a kultivací na trypton, aldehydy, které mohou být spontánně reaguje s amino skupiny přítomné na aminokyseliny a oligopeptidy v TB. Při použití média M9 s glukózou jako bází doplňujeme 0 až 2% kvasnicový extrakt nebo trypton, abychom stanovili optimální hladinu. Výsledky jsou shrnuty na obr. 5. Obrázek 5a ukazuje účinek koncentrace kvasnicového extraktu na produkci n-butyraldehydu po 24 hodinách anaerobní inkubace. titr n-Butyraldehydu nebyl významně citlivý na koncentraci extraktu kvasinek mezi 0,125 a 2%. Pokud však nebyl přidán žádný kvasnicový extrakt, bylo pozorováno pouze minimální množství n-butyraldehydu, což naznačuje význam komplexního zdroje dusíku. Zajímavé je, že ti, kteří používají M9 s kvasnicovým extraktem, měli vyšší poměr aldehyd-alkohol než poměr TB v důsledku vyšších hladin produkovaného butanolu. 48-h postanaerobní spínač (obr. 5b) vykazoval mírný pokles n-butyraldehydu a zvýšení titru n-butanolu, což ukazuje na funkční alkoholdehydrogenázu aktivně konvertující n-butyraldehydu na n-butanol.

n-Butyraldehyd výroba byla citlivější k kultivací na trypton koncentrace než kvasnicový extrakt kultury obsahující 0.125 a 0.25% trypton vykazoval nižší titr n-butyraldehydu ve srovnání s odpovídajícími koncentracemi kvasnicového extraktu (obr. 5c, d). Zvýšení koncentrace tryptonu vedlo ke zvýšení produkce n-butanolu, což naznačuje, že trypton přispěl ke snížení poměru aldehyd-alkohol pro použití TB jako produkčního média. Porovnáním složek extrakt z kvasnic a kultivací na trypton od výrobců manuální, všimli jsme si, že kultivací na trypton má vyšší podíl větších molekul s molekulovou hmotností v rozmezí než 500-2000 Da, což znamená větší množství oligopeptidy. Na druhé straně kvasnicový extrakt obsahuje většinou menší molekuly s molekulovou hmotností nižší než 250 Da. Je možné, že tento rozpor vedl k jiný výraz vzory, které mohou zahrnovat non-specifické nativní alkohol dehydrogenázy schopen snížit n-butyraldehyd. Přesný mechanismus, proč trypton způsobuje zvýšení produkce n-butanolu, je však nejasný.