Erneuerbare Synthese von n-Butyraldehyd aus Glucose durch engineered Escherichia coli

Auswahl der CoA-acylierenden Aldehyddehydrogenase für die n-Butyraldehydproduktion

n-Butyraldehyd ist ein Zwischenprodukt im Clostridium-CoA-abhängigen n-Butanol-Produktionsweg (Abb. 1b). Die bifunktionelle Aldehyd / Alkohol-Dehydrogenase AdhE2 katalysiert jedoch die direkte zweistufige Umwandlung von Butyryl-CoA in n-Butanol unter Umgehung von n-Butyraldehyd als Produkt. Um die Umwandlung von n-Butyraldehyd in n-Butanol zu vermeiden, ersetzten wir zuerst AdhE2 durch CoA-acylierende Aldehyddehydrogenase (Aldh), die nur die Umwandlung von Butyryl-CoA in n-Butyraldehyd katalysierte. Einige Clostridien wie Clostridium beijerinckii enthalten einzelne Aldh und Adh anstelle eines bifunktionellen Enzyms für die Butanolproduktion. Alternativ findet sich Aldh in den Abbauwegen für Ethanolamin und 1,3-Propandiol . Die Aldh aus Ethanolamin- und 1,3-Propandiol-Verwertungsoperonen sind jedoch nicht spezifisch für die Butyryl-CoA-Reduktion und es wurde zuvor gezeigt, dass sie Ethanol produzieren, wenn sie in E. coli exprimiert werden . Daher haben wir uns für die vorliegende Studie entschieden, mit Clostridium Aldh zu arbeiten. Basierend auf der Sequenz von aldh aus C. beijerinckii wählten wir zwei weitere Homologe aus C. saccharolyticum und C. saccharoperbutylacetonicum sowie eine Mutante aldh aus C. beijerinckii aus, die wir zuvor in unserem Labor isoliert hatten (siehe zusätzliche Datei 1 zu ihrer Sequenz). Diese vier aldh-Gene wurden einzeln in synthetische Operone mit den Genen kloniert, die notwendig sind, um Acetyl-CoA in Butyryl-CoA umzuwandeln (Abb. 1b). Diese synthetischen Operonen wurden durch native E. coli-Promotor von ack und adhE Gene, Pack und PadhE, die zuvor gezeigt wurden, um höhere Titer von Butanol im Vergleich zu IPTG-induzierbaren PLlacO1-Promotor zu produzieren. Hier wurden Pack und PadhE so definiert, dass sie die ribosomale Bindungsstelle und die nicht translatierte 5′-Region stromaufwärts ihrer entsprechenden Gene einschließen. atoB, aldh, crt und hbd wurden als ein Operon auf ein colE1-Ursprungs-Plasmid unter der Kontrolle von Pack kloniert. ter und fdh wurden individuell auf colA- bzw. pSC101-Ursprungs-Plasmiden unter der Kontrolle von PadhE exprimiert. Diese Plasmide wurden in den E. coli-Stamm JCL299 transformiert, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er effizient n-Butanol produziert und ldhA, adhE, frdBC und pta ausgeschaltet hat . Nachdem die gemischten Säuregärungswege ausgeschaltet wurden, kanalisiert JCL299 effizient Acetyl-CoA und NADH für die Synthese von n-Butyraldehyd. Wie erwartet zeigten die resultierenden Stämme aufgrund der Anwesenheit endogener Alkoholdehydrogenasen eine minimale Produktion von n-Butyraldehyd (Abb. 2a). Die Mehrheit der Fermentationsprodukte war n-Butanol über die Stämme, die die vier verschiedenen aldh-Gene exprimierten. Es ist bekannt, dass chromosomale yqhD, die für NADPH-abhängige Alkoholdehydrogenase kodiert, Aldehyde zu ihren entsprechenden Alkoholen reduziert und als Entgiftungsmechanismus hochaktiv ist . Daher haben wir yqhD in JCL299 ausgeschaltet und den Stamm ELeco1 erhalten. Durch Expression des n-Butyraldehydweges im Stamm ELeco1 wurde eine n-Butyraldehydproduktion beobachtet. Der beste Stamm ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22 produzierte 0,16 g/L n-Butyraldehyd (Abb. 2b). Das Aldehyd-Alkohol-Verhältnis betrug jedoch 0,39. Dieses niedrige Verhältnis von Aldehyd zu Alkohol weist auf das Vorhandensein anderer aktiver nativer Adh hin, die n-Butyraldehyd reduzieren können.

Verbesserung des Aldehyd-zu-Alkohol-Verhältnisses durch Ausschlagen von nativen Alkoholdehydrogenasen

Um die n-Butanolbildung zu verringern und das Aldehyd-zu-Alkohol-Verhältnis zu erhöhen, haben wir die Gene, die für andere native Adh kodieren, ausgeschaltet. Basierend auf früheren Arbeiten zur Isobutyraldehydproduktion deletierten wir acht adh-Gene, die wahrscheinlich zur Reduktion von n-Butyraldehyd beitragen: yjgB, fucO, eutG, ybbO, adhP, gldA, yahK und yghA. Diese Gene wurden ausgewählt, weil ihre Knockouts zu höheren Produktionstitern von Isobutyraldehyd führten. Wir haben jedes dieser adh-Gene sequentiell durch P1-Phagentransduktion mit der Keio-Sammlung ausgeschaltet. Da sich alle diese adh-Gene als wirksam zur Steigerung der Isobutyraldehydproduktion erwiesen haben, wurden sie ohne spezifische Reihenfolge ausgeschaltet. Die Ergebnisse der n-Butyraldehyd-Produktionstiter und des Aldehyd-Alkohol-Verhältnisses dieser Mutantenstämme sind in Fig. 3. Wir haben festgestellt, dass die durch ELeco1 / pKU48 / pRW18 / pRW22 erzielten Titer mit denen vergleichbar sind, die durch die veröffentlichte Patentanmeldung von Easel Biotechnologies erreicht wurden , die einen Stamm mit identischem Genotyp verwendete. Da jedoch die n-Butanol-Titer in ihrer Arbeit nicht angegeben wurden, können die Butyraldehyd-zu-Butanol-Verhältnisse nicht verglichen werden. Dennoch haben wir hier das Stammdesign weitergeführt und gezeigt, dass zusätzliche Knockouts von nativen adh-Genen zu einer signifikanten Reduktion von Butanol führten. Der endgültige Stamm KS8/pKU48/pRW18/pRW22 erreichte ein Aldehyd-zu-Alkohol-Verhältnis von 3,1, was einer achtfachen Verbesserung gegenüber Stamm KSO1/pKU48/pRW18/pRW22 entspricht. Hier stellten wir fest, dass Stamm KS7, der die gleichen Plasmide beherbergte, ein etwas höheres Aldehyd-zu-Alkohol-Verhältnis von 3,4 erreichte. Der Unterschied in den Aldehyd-zu-Alkohol-Verhältnissen lag jedoch im Fehlerbereich und war unbedeutend. Daher wurde der Stamm KS8 für nachgeschaltete Experimente verwendet. Unter den acht zusätzlichen adh, die wir ausschalteten, zeigten eutG, ybbO und yghA keinen Effekt zur Erhöhung des Aldehyd-Alkohol-Verhältnisses. Alle anderen adh-Knockouts trugen positiv zur Erhöhung des Aldehyd-Alkohol-Verhältnisses bei, was auf ihre native Expression und die Fähigkeit der entsprechenden Enzyme hinweist, n-Butyraldehyd zu reduzieren. Während das Aldehyd-zu-Alkohol-Verhältnis mit jedem adh-Gen-Knock-out zunahm, stieg der Titer von n-Butyraldehyd nicht signifikant an. Entsprechend verringerte sich auch der Glukoseverbrauch von Stämmen mit jedem zusätzlichen Adh-Gen-Knock-out (Abb. 3). Diese Ergebnisse zeigen, dass der Kohlenstofffluss reduziert wurde. Die Analyse der Thermodynamik jedes Schrittes ergab, dass die Reduktion von Butyryl-CoA zu n-Butyraldehyd mit ΔG ‚° von 7,7 kJ / mol (berechnet mit eQuilibrator) thermodynamisch ungünstig ist, was zu einer ineffizienten Umwandlung von Butyryl-CoA zu n-Butyraldehyd führen kann, insbesondere nachdem die n-Butyraldehydkonzentration einen bestimmten Schwellenwert erreicht hat. Es ist wahrscheinlich, dass sich der Glukosestoffwechsel aufgrund der Unfähigkeit zum NADH-Recycling verlangsamt, da die Produktion von n-Butyraldehyd verlangsamt wird. Da die native E. da Fermentationsgene (adhE, frdBC und ldhA) im Stamm KS8 ausgeschlagen wurden, wird die n-Butyraldehydproduktion zum einzigen verfügbaren fermentativen Weg, um NADH zurück zu NAD + zu recyceln. Wenn die n-Butyraldehyd-Biosynthese verlangsamt wird, steht weniger NAD + zur Verwendung in der Glykolyse zur Verfügung. Infolgedessen nimmt die Glukoseverbrauchsrate ab. Daher untersuchten wir als nächstes den Effekt der In-situ-Entfernung auf den n-Butyraldehyd-Produktionstiter.

Verbesserung des n-Butyraldehyd-Titers durch In-situ-Produktentfernung

Hier haben wir uns für die In–situ-Flüssig-Flüssig-Extraktion zur Entfernung von n-Butyraldehyd unter Verwendung von organischem Overlay entschieden. Dodecan und Oleylalkohol wurden als Extraktionsmittel aufgrund ihrer allgemeinen Anwendung und Nichttoxizität für mikrobielle Kulturen ausgewählt . Wir bestimmten den Verteilungskoeffizienten von n-Butyraldehyd in Wasser und den beiden organischen Lösungsmitteln durch Messung des Verhältnisses von n-Butyraldehyd, das sowohl in wässriger als auch in organischer Phase auftritt (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S2) nach kräftigem Mischen und anschließender stationärer Inkubation bei 37 ° C. Der ermittelte Verteilungskoeffizient für n-Butyraldehyd betrug 0,141 bzw. 0,764 für Dodecan und Oleylalkohol. Dieses Ergebnis zeigte, dass Oleylalkohol ein geeigneteres Extraktionsmittel für n-Butyraldehyd sein kann, da ein höherer Verteilungskoeffizient das höhere Verhältnis von n-Butyraldehyd in der organischen Schicht anzeigt. Diese beiden Extraktionsmittel sind für E. coli nur schwach toxisch, da das Wachstum des n-Butyraldehyd produzierenden Stammes, der entweder in Gegenwart von Dodecan oder Oleylalkohol kultiviert wurde, im Vergleich zur Kontrolle ohne Extraktionsmittel nur geringfügig erniedrigt war (Fig. 4a), unter Angabe der Eignung dieser Lösungsmittel für die in situ Extraktion. Wie in Fig. 4b, n-Butyraldehyd-Titer in Gegenwart von Extraktionsmittel deutlich verbessert. Konsistent für Dodecan und Oleylalkohol, mit 1 Volumen Extraktionsmittel übertrifft, dass mit 0,5 Volumen. Der beste Zustand unter Verwendung von Oleylalkohol mit einem Volumenverhältnis von 1: 1 Extraktionsmittel zu Kultur ergab über 0,6 g / l n-Butyraldehyd, was eine nahezu dreifache Verbesserung gegenüber keinem Extraktionsmittel darstellt. Wie erwartet übertraf Oleylalkohol Dodecan als Extraktionsmittel für n-Butyraldehyd (Fig. 4c), im Einklang mit den Partitionskoeffizienten.

Effekt der Verringerung der Medienkomplexität auf die n-Butyraldehydproduktion

Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von Hefeextrakt und Tryptonkonzentration auf die n-Butyraldehydproduktion. Die Verwendung von Hühnerbrühe (TB) ist aufgrund ihrer hohen Kosten in der Regel nicht kommerziell rentabel. Weiterhin sind Aldehyde reaktiv und können mit Aminen spontan Schiffsche Base bilden. Da TB hohe Mengen an Hefeextrakt und Trypton enthält, können Aldehyde wahrscheinlich spontan mit den Aminogruppen reagieren, die auf Aminosäuren und Oligopeptiden in TB vorhanden sind. Unter Verwendung von M9-Medien mit Glucose als Basis ergänzen wir 0 bis 2% Hefeextrakt oder Trypton, um einen optimalen Gehalt zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5. Abbildung 5a zeigt den Effekt der Hefeextraktkonzentration auf die Produktion von n-Butyraldehyd nach 24 h anaerober Inkubation. n-Butyraldehyd-Titer war nicht signifikant empfindlich gegenüber Hefeextraktkonzentration zwischen 0,125 und 2%. Wenn jedoch kein Hefeextrakt zugesetzt wurde, wurde nur eine minimale Menge an n-Butyraldehyd beobachtet, was auf die Bedeutung einer komplexen Stickstoffquelle hinweist. Interessanterweise hatten diejenigen, die M9 mit Hefeextrakt verwendeten, aufgrund des höheren Butanolgehalts ein höheres Aldehyd-Alkohol-Verhältnis als TB. 48-h post-anaerober Schalter (Abb. 5b) zeigte eine leichte Abnahme des n-Butyraldehyds und einen Anstieg des n-Butanoltiters, was darauf hindeutet, dass funktionelle Alkoholdehydrogenase n-Butyraldehyd aktiv in n-Butanol umwandelt.

die Produktion von n-Butyraldehyd war empfindlicher gegenüber der Tryptonkonzentration als die von Hefeextrakt als Kulturen mit 0,125 und 0.25% Trypton zeigten im Vergleich zu den entsprechenden Konzentrationen an Hefeextrakt einen niedrigeren n-Butyraldehydtiter (Abb. 5c, d). Eine Erhöhung der Tryptonkonzentration führte zu einer erhöhten n-Butanolproduktion, was darauf hindeutet, dass Trypton zu dem verringerten Aldehyd-Alkohol-Verhältnis für die Verwendung von TB als Produktionsmedium beitrug. Durch den Vergleich der Komponenten von Hefeextrakt und Trypton aus dem Herstellerhandbuch haben wir festgestellt, dass Trypton einen höheren Prozentsatz an größeren Molekülen mit einem Molekulargewicht im Bereich von 500-2000 Da aufweist, was auf eine größere Menge an Oligopeptiden hinweist. Andererseits enthält Hefeextrakt meist kleinere Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 250 Da. Es ist möglich, dass diese Diskrepanz zu unterschiedlichen Expressionsmustern führte, die unspezifische native Alkoholdehydrogenasen einschließen können, die n-Butyraldehyd reduzieren können. Nichtsdestotrotz ist der genaue Mechanismus, warum Trypton eine Zunahme der n-Butanol-Produktion verursacht, unklar.