Síntesis renovable de n-butiraldehído a partir de glucosa por Escherichia coli

Selección de aldehído deshidrogenasa coa-acilante para la producción de n-butiraldehído

el n-Butiraldehído es un intermediario en la vía de producción de n-butanol dependiente de COA de Clostridium (Fig. 1b). Sin embargo, la aldehído bifuncional/alcohol deshidrogenasa AdhE2 cataliza la conversión directa en dos pasos de butiril-CoA a n-butanol, sin pasar por el n-butiraldehído como producto. Para evitar la conversión de n-butiraldehído a n-butanol, primero reemplazamos AdhE2 con aldehído deshidrogenasa acilante CoA (Aldh), catalizando solo la conversión de butiril-CoA a n-butiraldehído. Algunos Clostridium, como Clostridium beijerinckii, contienen Aldh y Adh individuales en lugar de una enzima bifuncional para la producción de butanol. Alternativamente, la Aldh se encuentra en las vías de degradación de la etanolamina y el 1,3-propanodiol . Sin embargo, el Aldh de los operones de utilización de etanolamina y 1,3-propanodiol no es específico para la reducción de butiril-CoA y se ha demostrado previamente que produce etanol cuando se expresa en E. coli . Por lo tanto, para el presente estudio, optamos por trabajar con Clostridium Aldh. Con base en la secuencia de aldh de C. beijerinckii , seleccionamos dos homólogos adicionales de C. saccharolyticum y C. saccharoperbutylacetonicum, así como un aldh mutante de C. beijerinckii que aislamos previamente en nuestro laboratorio (ver el archivo adicional 1 para su secuencia). Estos cuatro genes aldh se clonaron individualmente en operones sintéticos con los genes necesarios para convertir acetil-CoA en butiril-CoA (Fig. 1b). Estos operones sintéticos fueron impulsados por el promotor nativo de E. coli de los genes ack y adhE, Pack y PadhE, respectivamente, que previamente han demostrado producir títulos más altos de butanol en comparación con el uso del promotor PLlacO1 inducible por IPTG . Aquí, el Pack y PadhE se definieron para incluir el sitio de unión ribosomal y la región no traducida de 5′ aguas arriba de sus genes correspondientes. atoB, aldh, crt y hbd se clonaron como un operón en un plásmido de origen colE1 bajo el control de Pack. ter y fdh se expresaron individualmente en plásmidos de origen COLA y pSC101, respectivamente, bajo el control de PadhE . Estos plásmidos se transformaron en la cepa de E. coli JCL299, que anteriormente se había demostrado que producía n-butanol de manera eficiente y tenía noqueados ldhA, adhE, frdBC y pta . Habiendo eliminado las vías de fermentación ácida mixta, JCL299 canaliza eficientemente acetil-CoA y NADH para la síntesis de n-butiraldehído. Como era de esperar, debido a la presencia de alcohol deshidrogenasas endógenas, las cepas resultantes mostraron una producción mínima de n-butiraldehído (Fig. 2a). La mayoría de los productos de fermentación eran n-butanol en las cepas que expresaban los cuatro genes aldh diferentes. Se sabe que la YQH cromosómica, que codifica la alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH, reduce los aldehídos a sus alcoholes correspondientes y es altamente activa como mecanismo de desintoxicación . Por lo tanto, eliminamos yqhD en JCL299, produciendo cepa ELeco1. Expresando la vía del n-butiraldehído en la cepa ELeco1, se observó la producción de n-butiraldehído. La mejor cepa ELeco1 / pKU48 / pRW18 / pRW22 produjo 0,16 g / L de n-butiraldehído (Fig. 2b). Sin embargo, la relación aldehído-alcohol fue de 0,39. Esta baja proporción aldehído-alcohol indica la presencia de otro Adh nativo activo capaz de reducir el n-butiraldehído.

Mejorando la relación aldehído-alcohol al eliminar las deshidrogenasas de alcohol nativas

Para disminuir la formación de n-butanol y aumentar la relación aldehído-alcohol, eliminamos los genes que codifican otras Adh nativas. Sobre la base de trabajos previos para la producción de isobutiraldehído, eliminamos ocho genes adh que probablemente contribuyan a la reducción de n-butiraldehído: yjgB, fucO, eutG, ybbO, adhP, gldA, yahK e yghA. Estos genes fueron seleccionados porque sus knockouts llevaron a títulos de producción más altos de isobutiraldehído. Eliminamos secuencialmente cada uno de estos genes adh usando transducción de fagos P1 con la colección Keio. Dado que se ha demostrado que todos estos genes adh son efectivos para aumentar la producción de isobutiraldehído, se eliminaron sin un orden específico. Los resultados de los títulos de producción de n-butiraldehído y la relación aldehído-alcohol de estas cepas mutantes se muestran en la Fig. 3. Observamos que los títulos obtenidos con el ELeco1 / pKU48/pRW18 / pRW22 son comparables a los obtenidos con la solicitud de patente publicada de Easel Biotechnologies , que utilizó una cepa con un genotipo idéntico. Sin embargo, debido a que los títulos de n-butanol no se notificaron en su trabajo, no se pueden comparar las proporciones de butiraldehído a butanol. Sin embargo, aquí llevamos el diseño de la cepa más allá y mostramos que los knockouts adicionales de los genes adh nativos llevaron a una reducción significativa del butanol. La cepa final KS8 / pKU48/pRW18/pRW22 alcanzó una relación aldehído-alcohol de 3,1, lo que representa una mejora de ocho veces en comparación con la cepa ELeco1/pKU48/pRW18 / pRW22. Aquí observamos que la cepa KS7 que albergaba los mismos plásmidos alcanzó una relación aldehído-alcohol ligeramente mayor de 3,4. Sin embargo, la diferencia en la proporción aldehído-alcohol estaba dentro del rango de error e insignificante. Por lo tanto, se utilizó la cepa KS8 para experimentos posteriores. Entre los ocho adh adicionales que eliminamos, eutG, ybbO e yghA no mostraron ningún efecto para aumentar la proporción aldehído-alcohol. Todas las demás eliminaciones de adh contribuyeron positivamente al aumento de la relación aldehído-alcohol, lo que indica su expresión nativa y la capacidad de las enzimas correspondientes de reducir el n-butiraldehído. Mientras que la relación aldehído-alcohol aumentó con cada eliminación del gen adh, el título de n-butiraldehído no aumentó significativamente. En consecuencia, el consumo de glucosa por cepas con cada eliminación adicional del gen adh también disminuyó (Fig. 3). Estos resultados indican que el flujo de carbono se redujo. El análisis de la termodinámica de cada paso reveló que la reducción de butiril-CoA a n-butiraldehído es termodinámicamente desfavorable con ΔG ‘ ° de 7,7 kJ / mol (calculado usando eQuilibrador), lo que puede conducir a una conversión ineficiente de butiril-CoA a n-butiraldehído, particularmente después de que la concentración de n-butiraldehído alcanzara un cierto umbral. Es probable que a medida que la producción de n-butiraldehído se ralentiza, el metabolismo de la glucosa también se ralentiza debido a la incapacidad para el reciclaje de NADH. Desde el nativo E. los genes de fermentación de coli (adhE, frdBC y ldhA) han sido eliminados en la cepa KS8, la producción de n-butiraldehído se convierte en la única vía fermentativa disponible para reciclar NADH de vuelta a NAD+. Cuando la biosíntesis de n-butiraldehído se ralentiza, se dispone de menos NAD+ para su uso en la glucólisis. Como resultado, la tasa de consumo de glucosa disminuye. Por lo tanto, a continuación investigamos el efecto de la eliminación in situ en el título de producción de n-butiraldehído.

Mejorar el título de n–butiraldehído mediante la eliminación in situ del producto

Aquí elegimos utilizar la extracción líquido-líquido in situ para la eliminación de n-butiraldehído mediante recubrimiento orgánico. El dodecano y el alcohol oleílico se seleccionaron como extractantes por su aplicación general y no toxicidad en cultivos microbianos . Determinamos el coeficiente de partición de n-butiraldehído en agua y los dos disolventes orgánicos midiendo la relación de n-butiraldehído que aparece en fase acuosa y orgánica (archivo adicional 1: Figura S2) después de una mezcla vigorosa seguida de incubación estacionaria a 37 °C. El coeficiente de partición determinado para n-butiraldehído fue de 0.141 y 0.764 para dodecano y alcohol oleílico, respectivamente. Este resultado indicó que el alcohol oleílico puede ser un extractante más adecuado para el n-butiraldehído, ya que un coeficiente de partición más alto indica la mayor proporción de n-butiraldehído que se encuentra en la capa orgánica. Estos dos extractantes solo son ligeramente tóxicos para E. coli, ya que el crecimiento de la cepa productora de n-butiraldehído cultivada en presencia de dodecano o alcohol oleílico solo disminuyó ligeramente en comparación con el control sin ningún extractante (Fig. 4a), indicando la idoneidad de estos disolventes para la extracción in situ. Como se muestra en la Fig. 4b, título de n-butiraldehído mejoró significativamente en presencia de extractante. Consistentemente, tanto para el dodecano como para el alcohol oleílico, el uso de 1 volumen de extractante supera al uso de 0,5 volumen. La mejor condición con alcohol oleílico con una relación de volumen de extractante a cultivo de 1: 1 produjo más de 0,6 g/L de n-butiraldehído, lo que representa una mejora casi tres veces superior a la ausencia de extractante. Como era de esperar, el alcohol oleílico superó al dodecano como extractante para el n-butiraldehído (Fig. 4c), consistente con los coeficientes de partición.

Efecto de la reducción de la complejidad de los medios en la producción de n-butiraldehído

A continuación, evaluamos el efecto del extracto de levadura y la concentración de triptona en la producción de n-butiraldehído. El uso de caldo excelente (TB) generalmente no es comercialmente viable debido a su costoso costo. Además, los aldehídos son reactivos y pueden formar espontáneamente la base de Schiff con aminas. Dado que la TB contiene altas cantidades de extracto de levadura y triptona, es probable que los aldehídos reaccionen espontáneamente con los grupos amino presentes en los aminoácidos y oligopéptidos de la TB. Utilizando medios M9 con glucosa como base, complementamos de 0 a 2% de extracto de levadura o triptona para determinar un nivel óptimo. Los resultados se resumen en la Fig. 5. La Figura 5a muestra el efecto de la concentración de extracto de levadura en la producción de n-butiraldehído después de 24 h de incubación anaeróbica. el título de n-butiraldehído no fue significativamente sensible a la concentración de extracto de levadura entre 0,125 y 2%. Sin embargo, si no se añadió extracto de levadura, solo se observó una cantidad mínima de n-butiraldehído, lo que indica la importancia de la fuente compleja de nitrógeno. Curiosamente, aquellos que usaron M9 con extracto de levadura tuvieron una relación aldehído-alcohol más alta que la que usaron TB debido a los niveles más altos de butanol producido. interruptor anaeróbico post-48 h (Fig. 5b) mostró una ligera disminución en el n-butiraldehído y un aumento en el título de n-butanol, lo que indica que la alcohol deshidrogenasa funcional convierte activamente el n-butiraldehído en n-butanol.

la producción de n-butiraldehído fue más sensible a la concentración de triptona que la del extracto de levadura como cultivos que contenían 0,125 y 0.el 25% de triptona mostró un título de n-butiraldehído más bajo en comparación con las concentraciones correspondientes de extracto de levadura (Fig. 5c, d). El aumento de la concentración de triptona condujo a un aumento de la producción de n-butanol, lo que indica que la triptona contribuyó a la disminución de la relación aldehído-alcohol para el uso de TB como medio de producción. Al comparar los componentes del extracto de levadura y la triptona del manual del fabricante, notamos que la triptona tiene un mayor porcentaje de moléculas más grandes con un peso molecular en el rango de 500-2000 Da, lo que indica una mayor cantidad de oligopéptidos. Por otro lado, el extracto de levadura contiene en su mayoría moléculas más pequeñas con un peso molecular inferior a 250 Da. Es posible que esta discrepancia condujo a diferentes patrones de expresión que pueden incluir deshidrogenasas de alcohol nativo inespecíficas capaces de reducir el n-butiraldehído. Sin embargo, el mecanismo exacto de por qué la triptona causa el aumento en la producción de n-butanol no está claro.