n-butyraldehydin uusiutuva synteesi glukoosista valmistetulla Escherichia coli-valmisteella

CoA-asyloivan aldehydidehydrogenaasin valinta n-butyraldehydin tuotantoa varten

n-Butyraldehydi on välituote Clostridium CoA-riippuvaisessa n-butanolin tuotantoreitissä (Kuva. 1b). Bifunktionaalinen aldehydi / alkoholidehydrogenaasi AdhE2 kuitenkin katalysoi butyryyli-CoA: n suoraa kaksivaiheista muuntumista n-butanoliksi ohittaen tuotteena n-butyraldehydin. Välttääksemme n-butyraldehydin muuntumisen n-butanoliksi korvasimme ensin AdhE2: n CoA-asyloivalla aldehydidehydrogenaasilla (Aldh) katalysoiden vain butyryyli-CoA: n muuntumista n-butyraldehydiksi. Jotkut klostridit, kuten Clostridium beijerinckii, sisältävät butanolin tuotantoon tarkoitetun bifunktionaalisen entsyymin sijaan yksittäisiä Aldh: ta ja Adh: ta. Vaihtoehtoisesti Aldh: ta esiintyy etanoliamiinin ja 1,3-propaanidiolin hajoamisreiteissä . Etanoliamiinin Aldh ja 1,3-propaanidiolin käyttöoperonit eivät kuitenkaan ole spesifisiä butyryyli-CoA: n pelkistämiseen, ja niiden on aiemmin osoitettu tuottavan etanolia E. coli-bakteerina ilmaistuna . Siksi, tässä tutkimuksessa, päätimme työskennellä Clostridium Aldh. Perustuen sekvenssi aldh alkaen C. beijerinckii, valitsimme kaksi ylimääräistä homologues alkaen C. saccharolyticum ja C. saccharoperbutylacetonicum, sekä mutantti aldh alkaen C. beijerinckii jonka eristimme aiemmin meidän lab (Katso ylimääräinen tiedosto 1 sen sekvenssi). Nämä neljä aldh-geeniä kloonattiin yksittäin synteettisiksi operoneiksi, joilla oli tarvittavat geenit muuttaa asetyyli-CoA butyryyli-CoA: ksi (kuva. 1b). Näiden synteettisten operonien veturina toimi ACK-ja Adhe-geenien E. coli-promoottori Pack ja PadhE, joiden on aiemmin osoitettu tuottavan korkeampia butanolitittereitä verrattuna IPTG-indusoituvan PLlacO1-promoottorin käyttöön . Tässä Pack ja PadhE määriteltiin sisältämään ribosomaalinen sitoutumiskohta ja 5′ transloitumaton Alue niiden vastaavien geenien yläjuoksulla. Atob, aldh, crt ja hbd kloonattiin yhtenä operonina colE1-alkuperäisellä plasmidilla Packin valvonnassa. Ter ja fdh ilmaistiin PadhE: n valvonnassa erikseen colA-ja pSC101-alkuperää olevilla plasmideilla . Nämä plasmidit muuntuivat E. coli-kannaksi JCL299, jonka on aiemmin osoitettu tuottavan tehokkaasti n-butanolia ja jonka ldhA, adhE, frdBC ja pta ovat hävinneet . Sekoitettujen happokäymisreittien jälkeen JCL299 kanavoi tehokkaasti asetyyli-CoA: ta ja NADH: TA n-butyraldehydin synteesiin. Kuten odotettiin, endogeenisten alkoholidehydrogenaasien läsnäolon vuoksi syntyneiden kantojen n-butyraldehydin tuotanto oli vähäistä (Fig. 2 a). Suurin osa käymistuotteista oli n-butanolia neljää eri aldh-geeniä ilmentävissä kannoissa. NADPH-riippuvaista alkoholidehydrogenaasia koodaavan kromosomaalisen yqhD: n tiedetään pelkistävän aldehydit vastaaviksi alkoholeiksi ja olevan hyvin aktiivinen detoksifikaatiomekanismina . Siksi tyrmäsimme yqhD: n jcl299: ssä, jolloin saatiin kanta ELeco1. Ilmentäen n-butyraldehydireittiä kannassa ELeco1 havaittiin n-butyraldehydin tuotantoa. Paras kanta ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22 tuotti 0,16 g / L n-butyraldehydiä (Kuva. 2b). Aldehydin ja alkoholin suhde oli kuitenkin 0,39. Tämä alhainen aldehydi-alkoholi-suhde osoittaa, että on olemassa muita aktiivisia natiiveja ADH: ta, jotka kykenevät pelkistämään n-butyraldehydiä.

parantamalla aldehydi-alkoholi-suhdetta tyrmäämällä alkuperäiset alkoholidehydrogenaasit

n-butanolin muodostumisen vähentämiseksi ja aldehydi-alkoholi-suhteen lisäämiseksi tyrmäsimme muita syntyperäisiä Adh: ta koodaavat geenit. Aiempien isobutyraldehydin tuotantoa koskevien tutkimusten perusteella poistimme kahdeksan adh-geeniä, jotka todennäköisesti vaikuttavat n-butyraldehydin vähentämiseen: yjgB, fucO, eutg, ybbO, adh, gldA, yahK ja yghA. Nämä geenit valittiin, koska niiden tyrmäykset johtivat isobutyraldehydin korkeampiin tuotantotittereihin. Tuhosimme kaikki ADH-geenit P1 – faagi-transduktiolla Keio-kokoelmalla. Koska kaikkien näiden adh-geenien on osoitettu lisäävän tehokkaasti isobutyraldehydin tuotantoa, ne tyrmättiin ilman erityistä järjestystä. N-butyraldehydin valmistustittereiden tulokset ja näiden mutanttikantojen aldehydi-alkoholi-suhde on esitetty Fig: ssä. 3. Totesimme , että Electro1/pKU48/pRW18/pRW22: n titterit ovat verrattavissa Easel Biotechnologies-yrityksen julkaistuun patenttihakemukseen, jossa käytettiin samaa genotyyppiä edustavaa kantaa. Koska n-butanolitittereitä ei kuitenkaan raportoitu heidän työssään, butyraldehydin ja butanolin välisiä suhteita ei voida verrata. Tässä kuitenkin veimme kannan rakennetta pidemmälle ja osoitimme, että native adh-geenien lisäpoikkeamat johtivat butanolin merkittävään vähenemiseen. Lopullinen kanta KS8/pKU48/pRW18/pRW22 saavutti aldehydi-alkoholi-suhteen 3, 1, mikä merkitsee kahdeksankertaista parannusta verrattuna kantaan ELeco1/pKU48/pRW18 / pRW22. Tässä huomasimme, että ks7-kanta, jossa on samat plasmidit, saavutti hieman korkeamman aldehydi-alkoholisuhteen 3,4. Ero aldehydin ja alkoholin välisissä suhteissa oli kuitenkin virhehaarukan sisällä ja merkityksetön. Siksi KS8-kantaa käytettiin loppupään kokeissa. Niiden kahdeksan adh: n lisäksi, jotka tyrmäsimme, eutg, ybbO ja yghA eivät osoittaneet mitään vaikutusta aldehydi-alkoholi-suhteen kasvattamiseen. Kaikki muut adh-tyrmäykset vaikuttivat myönteisesti aldehydin ja alkoholin välisen suhteen kasvuun, mikä osoitti niiden alkuperäisen ilmentymän ja vastaavien entsyymien kyvyn pelkistää n-butyraldehydiä. Vaikka aldehydin ja alkoholin suhde kasvoi jokaisen adh-geenin knock Outin myötä, n-butyraldehydin titteri ei kasvanut merkittävästi. Vastaavasti myös jokaisen ADH-lisägeenin omaavien kantojen glukoosinkulutus väheni (Kuva. 3). Tulokset viittaavat siihen, että hiilivuo väheni. Kunkin vaiheen termodynamiikan analyysi osoitti, että butyryyli-CoA: n pelkistyminen n-butyraldehydiksi on termodynaamisesti epäedullista ΔG’°: n ollessa 7,7 kJ/mol (laskettuna tasapainotuslaitteella), mikä voi johtaa butyryyli-CoA: n tehottomaan muuttumiseen n-butyraldehydiksi, erityisesti sen jälkeen, kun n-butyraldehydipitoisuus on saavuttanut tietyn kynnysarvon. On todennäköistä, että n-butyraldehydin tuotannon hidastuessa myös glukoosiaineenvaihdunta hidastuu NADH: n kierrätyksen kyvyttömyyden vuoksi. Alkuasukkaasta E. coli-fermentointigeenit (adhE, frdBC ja ldhA) on tyrmätty kannassa KS8, n-butyraldehydin tuotannosta tulee ainoa käytettävissä oleva fermentointireitti NADH: n kierrättämiseksi takaisin NAD+: ksi. Kun n-butyraldehydin biosynteesi hidastuu, on glykolyysissä käytettävissä vähemmän NAD+: ta. Tämän seurauksena glukoosin kulutus vähenee. Siksi tutkimme seuraavaksi in situ-poiston vaikutusta n-butyraldehydin tuotantotitteriin.

n-butyraldehydititterin parantaminen in situ – tuotteen poistolla

tässä yhteydessä päätimme käyttää in situ–neste-neste-uuttoa n-butyraldehydin poistoon orgaanisella Päällysteellä. Dodekaani ja oleyylialkoholi valittiin uuteaineiksi, koska niitä käytetään yleisesti ja koska ne eivät ole myrkyllisiä mikrobiviljelmille . Määritimme n-butyraldehydin jakaantumiskertoimen vedessä ja kahdessa orgaanisessa liuottimessa mittaamalla n-butyraldehydin osuuden sekä vesi-että orgaanisessa faasissa (Lisätiedosto 1: kuva S2) voimakkaan sekoittamisen jälkeen, jota seurasi stationaarinen inkubaatio 37 °C: ssa.n-butyraldehydin jakaantumiskerroin oli 0,141 ja oleyylialkoholin 0,764. Tämä tulos osoitti, että oleyylialkoholi saattaa olla sopivampi uute n-butyraldehydille, koska korkeampi jakautumiskerroin osoittaa orgaanisessa kerroksessa olevan n-butyraldehydin suuremman suhteen. Nämä kaksi uutetta ovat vain lievästi myrkyllisiä E. coli-bakteerille, koska dodekaani-tai oleyylialkoholin läsnä ollessa viljellyn n-butyraldehydiä tuottavan kannan kasvu hidastui vain hieman verrattuna kontrolliin, jossa ei ollut uutetta (Kuva. 4a), joka osoittaa näiden liuottimien soveltuvuuden in situ-uuttamiseen. Kuten tulokset on esitetty kuvassa. 4b, n-butyraldehydititteri parani merkittävästi uutteen läsnä ollessa. Johdonmukaisesti sekä dodekaanille että oleyylialkoholille, käyttäen 1 tilavuutta uutteen outperformeja, jotka käyttävät 0,5 tilavuutta. Parhaassa olotilassa, jossa käytettiin oleyylialkoholia uutteen ja viljelmän tilavuussuhteella 1:1, saatiin yli 0,6 g/L n-butyraldehydiä, mikä merkitsee lähes kolminkertaista parannusta verrattuna siihen, ettei uutetta ole. Odotetusti oleyylialkoholi päihitti dodekaanin n-butyraldehydin uuteaineena (Kuva. 4c) jakaantumiskertoimien mukaisesti.

väliaineen monimutkaisuuden vähentämisen vaikutus n-butyraldehydin tuotantoon

seuraavaksi arvioimme hiivauutteen ja tryptonipitoisuuden vaikutusta n-butyraldehydin tuotantoon. Käyttämällä loistava liemi (TB) ei yleensä ole kaupallisesti kannattavaa, koska sen kalliita kustannuksia. Lisäksi aldehydit ovat reaktiivisia ja voivat spontaanisti muodostaa Schiff-emäksen amiinien kanssa. Koska tuberkuloosi sisältää suuria määriä hiivauutetta ja tryptonia, aldehydit saattavat reagoida spontaanisti tuberkuloosin aminohappojen ja oligopeptidien aminoryhmien kanssa. Käyttämällä M9-mediaa, jonka pohjana on glukoosia, täydennämme 0-2% hiivauutetta tai tryptonia optimaalisen tason määrittämiseksi. Tulokset on tiivistetty Fig. 5. Kuvassa 5a esitetään hiivauutteen pitoisuuden vaikutus n-butyraldehydin tuotantoon 24 tunnin anaerobisen inkubaation jälkeen. n-Butyraldehydititteri ei ollut merkittävästi herkkä hiivauutteen pitoisuudelle 0,125-2%. Jos hiivauutetta ei kuitenkaan lisätty, havaittiin vain vähäinen määrä n-butyraldehydiä, mikä osoittaa monimutkaisen typpilähteen tärkeyden. On kiinnostavaa, että niillä, jotka käyttivät M9: ää hiivauutteen kanssa, oli korkeampi aldehydi-alkoholisuhde kuin niillä, jotka käyttivät TB: tä, koska niissä oli enemmän butanolia. 48-h post-anaerobinen kytkin (Kuva. 5b) osoitti n-butyraldehydin vähäistä vähenemistä ja n-butanolititterin lisääntymistä, mikä viittaa funktionaaliseen alkoholidehydrogenaasiin, joka muuttaa aktiivisesti n-butyraldehydiä n-butanoliksi.

n-Butyraldehydin tuotanto oli herkempää tryptonipitoisuudelle kuin hiivauutteen viljelminä, joissa oli 0,125 ja 0.25% tryptoni osoitti alhaisempi n-butyraldehydititteri verrattuna vastaaviin pitoisuuksiin hiivauute (Kuva. 5c, d). Tryptonipitoisuuden kasvu johti n-butanolin tuotannon lisääntymiseen, mikä osoittaa, että tryptoni vaikutti aldehydin ja alkoholin välisen suhteen alenemiseen käytettäessä TB: tä tuotantovälineenä. Vertaamalla hiivauutteen ja tryptonin komponentteja valmistajan käsikirjasta huomasimme, että tryptonilla on suurempi prosenttiosuus suurempia molekyylejä, joiden molekyylipaino on välillä 500-2000 Da, mikä viittaa suurempaan määrään oligopeptidejä. Toisaalta hiivauute sisältää enimmäkseen pienempiä molekyylejä, joiden molekyylipaino on alle 250 Da. On mahdollista, että tämä ristiriita johti erilaisiin ilmentymämalleihin, joihin voi kuulua n-butyraldehydiä pelkistäviä epäspesifisiä natiiveja alkoholidehydrogenaaseja. Tarkka mekanismi sille, miksi tryptoni aiheuttaa n-butanolin tuotannon lisääntymistä, on kuitenkin epäselvä.