Synthèse renouvelable de n-butyraldéhyde à partir de glucose par Escherichia coli d’ingénierie

Sélection d’aldéhyde déshydrogénase coa-acylante pour la production de n-butyraldéhyde

le n-Butyraldéhyde est un intermédiaire dans la voie de production de n-butanol dépendant du coa de Clostridium (Fig. 1b). Cependant, l’aldéhyde bifonctionnel / alcool déshydrogénase AdhE2 catalyse la conversion directe en deux étapes du butyryl-CoA en n-butanol, en contournant le n-butyraldéhyde en tant que produit. Pour éviter la conversion du n-butyraldéhyde en n-butanol, nous avons d’abord remplacé l’AdhE2 par une aldéhyde déshydrogénase coa-acylante (Aldh), catalysant uniquement la conversion du butyryl-CoA en n-butyraldéhyde. Certains Clostridia tels que Clostridium beijerinckii contiennent des Aldh et des Adh individuels au lieu d’une enzyme bifonctionnelle pour la production de butanol. Alternativement, l’Aldh se trouve dans les voies de dégradation de l’éthanolamine et du 1,3-propanediol. Cependant, l’Aldh des opérons d’utilisation de l’éthanolamine et du 1,3-propanediol n’est pas spécifique de la réduction du butyryl-CoA et il a été démontré précédemment qu’il produisait de l’éthanol lorsqu’il était exprimé dans E. coli. Par conséquent, pour la présente étude, nous avons choisi de travailler avec Clostridium Aldh. Sur la base de la séquence d’aldh de C. beijerinckii, nous avons sélectionné deux homologues supplémentaires de C. saccharolyticum et de C. saccharoperbutylacetonicum, ainsi qu’un aldh mutant de C. beijerinckii que nous avons isolé précédemment dans notre laboratoire (voir fichier supplémentaire 1 pour sa séquence). Ces quatre gènes aldh ont été clonés individuellement en opérons synthétiques avec les gènes nécessaires pour convertir l’acétyl-CoA en butyryl-CoA (Fig. 1b). Ces opérons synthétiques ont été pilotés par le promoteur natif d’E. coli des gènes ack et adhE, Pack et PadhE, respectivement, qui ont été précédemment montrés pour produire des titres plus élevés de butanol par rapport à l’utilisation du promoteur PLlacO1 inductible IPTG. Ici, le Pack et le PadhE ont été définis pour inclure le site de liaison ribosomique et la région 5′ non traduite en amont de leurs gènes correspondants. atoB, aldh, crt et hbd ont été clonés en un seul opéron sur un plasmide d’origine colE1 sous le contrôle de Pack. le ter et le fdh ont été exprimés individuellement sur les plasmides d’origine colA et pSC101, respectivement, sous le contrôle de PadhE. Ces plasmides ont été transformés en la souche d’E. coli JCL299 qui a précédemment montré produire efficacement du n-butanol et a éliminé la ldhA, l’adhE, le frdBC et le pta. Ayant éliminé les voies de fermentation acide mixte, JCL299 canalise efficacement l’acétyl-CoA et le NADH pour la synthèse du n-butyraldéhyde. Comme prévu, en raison de la présence d’alcool déshydrogénases endogènes, les souches résultantes ont montré une production minimale de n-butyraldéhyde (Fig. 2 bis). La majorité des produits de fermentation était du n-butanol dans les souches exprimant les quatre gènes aldh différents. L’yqhD chromosomique, codant pour l’alcool déshydrogénase NADPH-dépendante, est connu pour réduire les aldéhydes en leurs alcools correspondants et très actif comme mécanisme de détoxication. Par conséquent, nous avons éliminé yqhD dans JCL299, donnant la souche ELeco1. En exprimant la voie du n-butyraldéhyde dans la souche ELeco1, on a observé une production de n-butyraldéhyde. La meilleure souche ELeco1/ pKU48/pRW18/pRW22 a produit 0,16 g/L de n-butyraldéhyde (Fig. 2b). Cependant, le rapport aldéhyde/alcool était de 0,39. Ce faible rapport aldéhyde/alcool indique la présence d’autres Adh natifs actifs capables de réduire le n-butyraldéhyde.

Améliorer le rapport aldéhyde-alcool en éliminant les déshydrogénases d’alcool natives

Pour diminuer la formation de n-butanol et augmenter le rapport aldéhyde-alcool, nous avons éliminé les gènes codant pour d’autres Adh natifs. Sur la base de travaux antérieurs pour la production d’isobutyraldéhyde, nous avons supprimé huit gènes adh susceptibles de contribuer à la réduction du n-butyraldéhyde: yjgB, fucO, eutG, ybbO, adhP, gldA, yahK et yghA. Ces gènes ont été sélectionnés parce que leur élimination entraînait des titres de production plus élevés d’isobutyraldéhyde. Nous avons éliminé séquentiellement chacun de ces gènes adh en utilisant la transduction du phage P1 avec la collection Keio. Comme tous ces gènes adh se sont avérés efficaces pour augmenter la production d’isobutyraldéhyde, ils ont été éliminés sans ordre spécifique. Les résultats des titres de production de n-butyraldéhyde et du rapport aldéhyde/alcool de ces souches mutantes sont illustrés à la Fig. 3. Nous avons constaté que les titres obtenus par l’ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22 sont comparables à ceux obtenus par la demande de brevet publiée de la société Easel Biotechnologies, qui utilisait une souche de génotype identique. Cependant, comme les titres de n-butanol n’ont pas été rapportés dans leurs travaux, les rapports butyraldéhyde-butanol ne peuvent pas être comparés. Néanmoins, nous avons poussé la conception de la souche plus loin et avons montré que des éliminations supplémentaires de gènes adh natifs entraînaient une réduction significative du butanol. La souche finale KS8/ pKU48/pRW18/ pRW22 a atteint un rapport aldéhyde/alcool de 3,1, ce qui représente une amélioration octuple par rapport à la souche ELeco1/ pKU48/pRW18/pRW22. Nous avons noté ici que la souche KS7 hébergeant les mêmes plasmides atteignait un rapport aldéhyde/alcool légèrement plus élevé de 3,4. Cependant, la différence dans les rapports aldéhyde/alcool était dans la plage d’erreur et insignifiante. Par conséquent, la souche KS8 a été utilisée pour des expériences en aval. Parmi les huit adh supplémentaires que nous avons éliminés, eutG, ybbO et yghA n’ont montré aucun effet sur l’augmentation du rapport aldéhyde / alcool. Toutes les autres éliminations d’adh ont contribué positivement à l’augmentation du rapport aldéhyde-alcool, indiquant leur expression native et la capacité des enzymes correspondantes à réduire le n-butyraldéhyde. Alors que le rapport aldéhyde/alcool augmentait à chaque élimination du gène adh, le titre du n-butyraldéhyde n’augmentait pas significativement. En conséquence, la consommation de glucose par les souches avec chaque gène adh supplémentaire a également diminué (Fig. 3). Ces résultats indiquent que le flux de carbone a été réduit. L’analyse de la thermodynamique de chaque étape a révélé que la réduction du butyryl-CoA en n-butyraldéhyde est thermodynamiquement défavorable avec ΔG’° de 7,7 kJ/ mol (calculée à l’aide d’un équilibreur), ce qui peut conduire à une conversion inefficace du butyryl-CoA en n-butyraldéhyde, en particulier après que la concentration en n-butyraldéhyde ait atteint un certain seuil. Il est probable que lorsque la production de n-butyraldéhyde est ralentie, le métabolisme du glucose ralentit également en raison de l’impossibilité de recycler le NADH. Depuis le natif E. les gènes de fermentation de coli (adhE, frdBC et ldhA) ont été éliminés dans la souche KS8, la production de n-butyraldéhyde devient la seule voie fermentative disponible pour recycler le NADH en NAD +. Lorsque la biosynthèse du n-butyraldéhyde est ralentie, moins de NAD+ est disponible pour la glycolyse. En conséquence, le taux de consommation de glucose diminue. Par conséquent, nous avons ensuite étudié l’effet de l’élimination in situ sur le titre de production de n-butyraldéhyde.

Amélioration du titre de n–butyraldéhyde par élimination in situ du produit

Ici, nous avons choisi d’utiliser l’extraction liquide-liquide in situ pour l’élimination du n-butyraldéhyde en utilisant une superposition organique. Le dodécane et l’alcool oléylique ont été choisis comme extractants en raison de leur application générale et de leur non-toxicité pour les cultures microbiennes. Nous avons déterminé le coefficient de partage du n-butyraldéhyde dans l’eau et des deux solvants organiques en mesurant le rapport du n-butyraldéhyde apparaissant à la fois en phase aqueuse et en phase organique (fichier supplémentaire 1: Figure S2) après un mélange vigoureux suivi d’une incubation stationnaire à 37 °C. Le coefficient de partage déterminé pour le n-butyraldéhyde était respectivement de 0,141 et 0,764 pour le dodécane et l’alcool oléylique. Ce résultat indique que l’alcool oléylique peut être un agent d’extraction plus approprié pour le n-butyraldéhyde car un coefficient de partage plus élevé indique le rapport plus élevé de n-butyraldéhyde trouvé dans la couche organique. Ces deux agents d’extraction ne sont que faiblement toxiques pour E. coli car la croissance de la souche productrice de n-butyraldéhyde cultivée en présence de dodécane ou d’alcool oléique n’a été que légèrement réduite par rapport au témoin sans aucun agent d’extraction (Fig. 4a), indiquant l’aptitude de ces solvants à l’extraction in situ. Comme le montrent les résultats de la Fig. 4b, titre de n-butyraldéhyde significativement amélioré en présence d’extractant. Toujours pour le dodécane et l’alcool oléylique, l’utilisation de 1 volume d’extractant surpasse celle de 0,5 volume. La meilleure condition utilisant de l’alcool oléylique avec un rapport volumique extractant / culture de 1: 1 produit plus de 0,6 g / L de n-butyraldéhyde, ce qui représente une amélioration presque triple par rapport à l’absence d’extractant. Comme prévu, l’alcool oléylique a surpassé le dodécane en tant qu’agent d’extraction du n-butyraldéhyde (Fig. 4c), compatibles avec les coefficients de partage.

Effet de la réduction de la complexité des milieux sur la production de n-butyraldéhyde

Ensuite, nous avons évalué l’effet de l’extrait de levure et de la concentration de tryptone sur la production de n-butyraldéhyde. L’utilisation de bouillon formidable (TB) n’est généralement pas commercialement viable en raison de son coût élevé. De plus, les aldéhydes sont réactifs et peuvent former spontanément une base de Schiff avec des amines. Étant donné que la tuberculose contient de grandes quantités d’extrait de levure et de tryptone, les aldéhydes peuvent probablement réagir spontanément avec les groupes aminés présents sur les acides aminés et les oligopeptides dans la tuberculose. En utilisant un milieu M9 avec du glucose comme base, nous complétons 0 à 2% d’extrait de levure ou de tryptone pour déterminer un niveau optimal. Les résultats sont résumés à la Fig. 5. La figure 5a montre l’effet de la concentration d’extrait de levure sur la production de n-butyraldéhyde après 24 h d’incubation anaérobie. le titre de n-Butyraldéhyde n’était pas significativement sensible à la concentration d’extrait de levure comprise entre 0,125 et 2%. Cependant, si aucun extrait de levure n’a été ajouté, seule une quantité minimale de n-butyraldéhyde a été observée, indiquant l’importance de la source d’azote complexe. Fait intéressant, ceux qui utilisaient M9 avec de l’extrait de levure avaient un rapport aldéhyde-alcool plus élevé que celui qui utilisait la tuberculose en raison de niveaux plus élevés de butanol produit. interrupteur post-anaérobie 48 h (Fig. 5b) ont montré une légère diminution du n-butyraldéhyde et une augmentation du titre du n-butanol, ce qui indique que l’alcool déshydrogénase fonctionnelle convertit activement le n-butyraldéhyde en n-butanol.

la production de n-Butyraldéhyde était plus sensible à la concentration en tryptone que celle de l’extrait de levure car les cultures contenaient 0,125 et 0.25% de tryptone ont montré un titre de n-butyraldéhyde inférieur par rapport aux concentrations correspondantes d’extrait de levure (Fig. 5c, d). L’augmentation de la concentration de tryptone a entraîné une augmentation de la production de n-butanol, ce qui indique que la tryptone a contribué à l’abaissement du rapport aldéhyde-alcool pour l’utilisation de la tuberculose comme milieu de production. En comparant les composants de l’extrait de levure et de la tryptone du manuel du fabricant, nous avons remarqué que la tryptone a un pourcentage plus élevé de molécules plus grosses avec un poids moléculaire compris entre 500 et 2000 Da, ce qui indique une plus grande quantité d’oligopeptides. D’autre part, l’extrait de levure contient principalement des molécules plus petites de poids moléculaire inférieur à 250 Da. Il est possible que cette divergence ait conduit à des schémas d’expression différents qui peuvent inclure des alcool déshydrogénases natives non spécifiques capables de réduire le n-butyraldéhyde. Néanmoins, le mécanisme exact expliquant pourquoi la tryptone provoque une augmentation de la production de n-butanol n’est pas clair.