n-butiraldehid megújuló szintézise glükózból mesterséges Escherichia coli által

CoA-acilező aldehid-dehidrogenáz kiválasztása n-butiraldehid előállításához

az n-Butiraldehid a Clostridium CoA-függő n-butanol előállítási útvonalának köztiterméke (ábra. 1b). A bifunkcionális aldehid / alkohol-dehidrogenáz AdhE2 azonban katalizálja a butiril-CoA közvetlen kétlépcsős átalakulását n-butanollá, megkerülve az n-butiraldehidet mint terméket. Az n-butiraldehid n-butanollá történő átalakulásának elkerülése érdekében először az AdhE2-t CoA-acilező aldehid-dehidrogenázzal (Aldh) helyettesítettük, csak a butiril-CoA átalakulását katalizálva n-butiraldehiddé. Néhány Clostridium, mint például a Clostridium beijerinckii, egyedi Aldh-t és Adh-t tartalmaz a butanol előállítására szolgáló bifunkcionális enzim helyett. Alternatív megoldásként az Aldh az etanol-amin és az 1,3-propándiol lebomlási útvonalaiban is megtalálható . Az etanol-aminból és az 1,3-propándiol hasznosítási operonokból származó Aldh azonban nem specifikus a butiril-CoA redukcióra, és korábban kimutatták, hogy E. coli-ban kifejezve etanolt termel . Ezért a jelen tanulmányhoz úgy döntöttünk, hogy a Clostridium Aldh-val dolgozunk. A C. beijerinckii aldh-szekvenciája alapján két további homológot választottunk ki a C. saccharolyticum és a C. saccharoperbutylacetonicum-ból, valamint egy C. beijerinckii mutáns aldh-t, amelyet korábban laboratóriumunkban izoláltunk (szekvenciáját lásd az 1.kiegészítő fájlban). Ezt a négy aldh gént egyenként klónozták szintetikus operonokká az acetil-CoA butiril-CoA-vá történő átalakításához szükséges génekkel (ábra. 1b). Ezeket a szintetikus operonokat az ACK és az adhE gének natív E. coli promoterje, a Pack és a PadhE vezérelte, amelyekről korábban kimutatták, hogy magasabb butanol titereket termelnek, mint az IPTG-indukálható PLlacO1 promoter . Itt a csomagot és a PadhE-t úgy határozták meg, hogy tartalmazzák a riboszomális kötőhelyet és az 5′ nem transzlált régiót a megfelelő gének előtt. az atoB, az aldh, a crt és a hbd-t egy operonként klónozták egy colE1 eredetű plazmidon a Pack ellenőrzése alatt. a ter-t és az fdh-t egyenként fejezték ki colA és pSC101 eredetű plazmidokon, a PadhE ellenőrzése alatt . Ezeket a plazmidokat E. coli jcl299 törzsgé alakították át, amelyről korábban kimutatták, hogy hatékonyan termel n-butanolt, és ldhA, adhE, frdBC és pta kiütötte . Miután a kevert savas fermentációs utakat kiütötte, a JCL299 hatékonyan csatornázza az acetil-CoA-t és a NADH-t az n-butiraldehid szintéziséhez. Amint az várható volt, az endogén alkohol-dehidrogenázok jelenléte miatt a kapott törzsek minimális n-butiraldehid termelést mutattak (ábra. 2a). A fermentációs termékek többsége n-butanol volt a négy különböző aldh gént expresszáló törzsekben. A NADPH-függő alkohol-dehidrogenázt kódoló kromoszómális yqhD ismert, hogy az aldehideket megfelelő alkoholokká redukálja, méregtelenítő mechanizmusként pedig nagyon aktív . Ezért kiütöttük az yqhD-t a JCL299-ben, így az ELeco1 törzset kaptuk. Az N-butiraldehid útvonal kifejezése az ELeco1 törzsben, n-butiraldehid termelést figyeltek meg. A legjobb törzs ELeco1 / pKU48 / pRW18 / pRW22 előállított 0,16 g / L n-butiraldehid (ábra. 2b). Az aldehid / alkohol arány azonban 0,39 volt. Ez az alacsony aldehid-alkohol arány más aktív natív Adh jelenlétét jelzi, amely képes csökkenteni az n-butiraldehidet.

az aldehid-alkohol arány javítása a natív alkohol-dehidrogenázok

kiütésével az n-butanol képződésének csökkentése és az aldehid-alkohol arány növelése érdekében kiütöttük a többi natív Adh-t kódoló géneket. Az izobutiraldehid előállításával kapcsolatos korábbi munkák alapján nyolc adh gént töröltünk, amelyek valószínűleg hozzájárulnak az n-butiraldehid csökkentéséhez: yjgB, fucO, eutG, ybbO, adhP, gldA, yahK és yghA. Ezeket a géneket azért választottuk ki, mert kiütéseik az izobutiraldehid magasabb termelési titeréhez vezettek. Ezeket az adh géneket egymás után kiütöttük P1 fág transzdukcióval a Keio gyűjtemény. Mivel ezeknek az adh géneknek kimutatták, hogy hatékonyak az izobutiraldehid termelés növelésében, külön sorrend nélkül kiütötték őket. Ezen mutáns törzsek n-butiraldehid termelési titereinek és aldehid / alkohol arányának eredményeit az ábrán mutatjuk be. 3. Megállapítottuk , hogy az ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22 által elért titerek összehasonlíthatók a festőállvány biotechnológiáinak közzétett szabadalmi bejelentésével elért titerekkel, amelyek azonos genotípusú törzset használtak. Mivel azonban az n-butanol titereket munkájuk során nem jelentették, a butiraldehid / butanol arányokat nem lehet összehasonlítani. Mindazonáltal itt tovább vittük a törzs tervezését, és megmutattuk, hogy a natív adh gének további kiesése a butanol jelentős csökkenéséhez vezetett. A végső KS8/pKU48/pRW18/pRW22 törzs 3,1 aldehid-alkohol arányt ért el, ami nyolcszoros javulást jelent az ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22 törzshez képest. Itt megjegyeztük, hogy az azonos plazmidokat hordozó KS7 törzs valamivel magasabb, 3,4-es aldehid-alkohol arányt ért el. Az aldehid / alkohol arányok különbsége azonban hibahatáron belül volt és jelentéktelen. Ezért a KS8 törzset a downstream kísérletekhez használtuk. A nyolc további adh közül, amelyeket kiütöttünk, az eutG, az ybbO és az yghA nem mutatott hatást az aldehid / alkohol arány növelésére. Az összes többi adh knock out pozitívan járult hozzá az aldehid / alkohol arány növeléséhez, jelezve natív expressziójukat és a megfelelő enzimek képességét az n-butiraldehid csökkentésére. Míg az aldehid-alkohol arány minden adh gén kiesésével nőtt, az n-butiraldehid titere nem nőtt szignifikánsan. Ennek megfelelően a törzsek glükózfogyasztása minden további adh gén kiütésével szintén csökkent (ábra. 3). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a szénáram csökkent. Az egyes lépések termodinamikájának elemzése során kiderült, hogy a butiril-CoA redukció n-butiraldehiddé termodinamikailag kedvezőtlen, ha a 7,7 kJ/mol (ekvilibrátor alkalmazásával számítva) a butiril-CoA nem hatékony átalakulását eredményezheti n-butiraldehiddé, különösen azután, hogy az n-butiraldehid koncentrációja elért egy bizonyos küszöböt. Valószínű, hogy mivel az n-butiraldehid termelése lelassul, a glükóz metabolizmusa is lelassul a NADH újrahasznosításának képtelensége miatt. Mivel a natív E. coli fermentációs gének (adhE, frdBC és ldhA) már kiütötte törzs KS8, n-butiraldehid termelés lesz az egyetlen fermentációs út áll rendelkezésre, hogy újra NADH vissza NAD+. Ha az n-butiraldehid bioszintézise lelassul, kevesebb nad+ áll rendelkezésre a glikolízishez. Ennek eredményeként csökken a glükózfogyasztási Arány. Ezért ezután megvizsgáltuk az in situ eltávolítás hatását az n-butiraldehid termelési titerre.

az n-butiraldehid titer javítása in situ termék eltávolítással

itt úgy döntöttünk, hogy IN situ folyadék–folyadék extrakciót használunk az n-butiraldehid eltávolításához szerves átfedés alkalmazásával. A dodekánt és az oleilalkoholt extrahálószerként választották ki általános alkalmazásuk és a mikrobiális tenyészetekre gyakorolt toxicitásuk miatt . Az n-butiraldehid megoszlási hányadosát vízben és a két szerves oldószerben úgy határoztuk meg, hogy megmértük a vizes és a szerves fázisban egyaránt megjelenő n-butiraldehid arányát (további fájl 1: S2 ábra) erőteljes keverés után, majd stacionárius inkubálás után 37 C. a meghatározott Megoszlási hányados az n-butiraldehid esetében 0,141, illetve 0,764 volt a dodekán és az oleilalkohol esetében. Ez az eredmény azt jelezte, hogy az oleilalkohol alkalmasabb extrahálószer lehet az n-butiraldehid számára, mivel a magasabb megoszlási együttható a szerves rétegben található n-butiraldehid nagyobb arányát jelzi. Ez a két extrahálószer csak enyhén mérgező az E. coli-ra, mivel a dodekán vagy oleilalkohol jelenlétében termesztett n-butiraldehid-termelő törzs növekedése csak kismértékben csökkent az extrahálószer nélküli kontrollhoz képest (ábra. 4a), jelezve ezen oldószerek in situ extrakcióra való alkalmasságát. Amint eredmények ábrán látható. 4B, n-butiraldehid titer szignifikánsan javult extrahálószer jelenlétében. Következetesen mind a dodekán, mind az oleilalkohol esetében 1 térfogat extraktáns használata felülmúlja a 0,5 térfogatot. A legjobb állapot oleilalkohol alkalmazásával, 1: 1 extrahálószer-tenyészet térfogataránnyal, 0,6 g/L N-butiraldehid felett, ami közel háromszoros javulást jelent az extrahálószer nélkül. Ahogy az várható volt, az oleilalkohol felülmúlta a dodekánt az n-butiraldehid extrahálószereként (ábra. 4C), összhangban a megoszlási együtthatókkal.

a Média komplexitásának csökkentése az n-butiraldehid termelésre

ezután értékeltük az élesztőkivonat és a tripton koncentráció hatását az n-butiraldehid termelésre. A félelmetes húsleves (TB) használata drága költségei miatt általában nem kereskedelmi szempontból életképes. Ezenkívül az aldehidek reaktívak, és spontán módon Schiff-bázist képezhetnek aminokkal. Mivel a TB nagy mennyiségben tartalmaz élesztőkivonatot és triptont, az aldehidek valószínűleg spontán reakcióba léphetnek a TB aminosavain és oligopeptidjein jelen lévő aminocsoportokkal. Az M9 táptalajt glükóz alapként használva 0-2% élesztőkivonatot vagy triptont adunk hozzá az optimális szint meghatározásához. Az eredményeket az ábra foglalja össze. 5. Az 5a. ábra az élesztőkivonat koncentrációjának hatását mutatja az n-butiraldehid termelésére 24 óra anaerob inkubáció után. az n-Butiraldehid titer nem volt szignifikánsan érzékeny az élesztőkivonat 0,125 és 2% közötti koncentrációjára. Ha azonban nem adtak hozzá élesztőkivonatot, csak minimális mennyiségű n-butiraldehidet figyeltek meg, jelezve a komplex nitrogénforrás fontosságát. Érdekes módon azok, akik az M9-et élesztőkivonattal használják, magasabb aldehid-alkohol arányt mutattak, mint a TB-t használó butanol magasabb szintje miatt. 48-h poszt-anaerob kapcsoló (ábra. 5b) az n-butiraldehid enyhe csökkenését és az n-butanol titer növekedését mutatta, ami azt jelzi, hogy a funkcionális alkohol-dehidrogenáz aktívan átalakítja az n-butiraldehidet n-butanollá.

az n-Butiraldehid termelés érzékenyebb volt a tripton koncentrációjára, mint az élesztőkivonat, mivel a tenyészetek 0,125 és 0-at tartalmaznak.A 25% – os tripton alacsonyabb n-butiraldehid titert mutatott az élesztőkivonat megfelelő koncentrációihoz képest (ábra. 5c, d). A növekvő triptonkoncentráció az n-butanol termelés növekedéséhez vezetett, jelezve, hogy a tripton hozzájárult a csökkent aldehid / alkohol arányhoz a TB termelési közegként történő felhasználásához. Az élesztőkivonat és a tripton összetevőinek összehasonlításával a gyártók kézikönyvében észrevettük, hogy a tripton nagyobb százalékban tartalmaz nagyobb molekulatömegű molekulákat, mint 500-2000 Da, ami nagyobb mennyiségű oligopeptidet jelez. Másrészt az élesztőkivonat többnyire kisebb molekulákat tartalmaz, amelyek molekulatömege kevesebb, mint 250 Da. Lehetséges, hogy ez az eltérés különböző expressziós mintákhoz vezetett, amelyek tartalmazhatnak nem specifikus natív alkohol-dehidrogenázokat, amelyek képesek csökkenteni az n-butiraldehidet. Ennek ellenére a pontos mechanizmus, hogy a tripton miért okozza az n-butanol termelés növekedését, nem világos.