Sintesi rinnovabile di n-butiraldeide da glucosio mediante Escherichia coli ingegnerizzata

Selezione di aldeide deidrogenasi coa-acilante per la produzione di n-butiraldeide

la n-butiraldeide è un intermedio nella via di produzione di n-butanolo dipendente dal COA del clostridio (Fig. 1 ter). Tuttavia, l’aldeide bifunzionale / alcool deidrogenasi AdhE2 catalizza la conversione diretta in due fasi del butiril-CoA in n-butanolo, bypassando la n-butiraldeide come prodotto. Per evitare la conversione di n-butirraldeide in n-butanolo, abbiamo prima sostituito AdhE2 con COA-acilante aldeide deidrogenasi (Aldh), catalizzando solo la conversione di butiril-CoA in n-butirraldeide. Alcuni clostridi come il Clostridium beijerinckii contengono Aldh e Adh individuali invece di un enzima bifunzionale per la produzione di butanolo. In alternativa, Aldh si trova nelle vie di degradazione per etanolamina e 1,3-propandiolo . Tuttavia, l’Aldh da etanolamina e gli operoni di utilizzo di 1,3-propandiolo non sono specifici per la riduzione del butiril-CoA e hanno dimostrato in precedenza di produrre etanolo quando espresso in E. coli . Pertanto, per il presente studio, abbiamo scelto di lavorare con Clostridium Aldh. Sulla base della sequenza di aldh da C. beijerinckii , abbiamo selezionato due omologhi aggiuntivi da C. saccharolyticum e C. saccharoperbutylacetonicum, così come un aldh mutante da C. beijerinckii che abbiamo isolato in precedenza nel nostro laboratorio (vedere il file aggiuntivo 1 per la sua sequenza). Questi quattro geni aldh sono stati clonati individualmente in operoni sintetici con i geni necessari per convertire l’acetil-CoA in butirril-CoA (Fig. 1 ter). Questi operoni sintetici sono stati guidati dal promotore nativo di E. coli dei geni ack e adhE, Pack e PadhE, rispettivamente, che in precedenza hanno dimostrato di produrre titoli più elevati di butanolo rispetto all’utilizzo del promotore PLlacO1 inducibile IPTG . Qui il Pack e il PadhE sono stati definiti per includere il sito di legame ribosomiale e la regione non tradotta 5 ‘ a monte dei loro geni corrispondenti. atoB, aldh, crt e hbd sono stati clonati come un operone su un plasmide di origine colE1 sotto il controllo di Pack. ter e fdh sono stati espressi individualmente su plasmidi di origine colA e pSC101, rispettivamente, sotto il controllo di PadhE . Questi plasmidi sono stati trasformati in E. coli ceppo JCL299 che è stato precedentemente dimostrato di produrre in modo efficiente n-butanolo e ha ldhA, adhE, frdBC, e pta eliminato . Avendo i percorsi di fermentazione acida mista eliminato, JCL299 canali in modo efficiente acetil-CoA e NADH per la sintesi di n-butirraldeide. Come previsto, a causa della presenza di alcol deidrogenasi endogeni, i ceppi risultanti hanno mostrato una produzione minima di n-butiraldeide (Fig. 2 bis). La maggior parte dei prodotti di fermentazione era n-butanolo attraverso i ceppi che esprimevano i quattro diversi geni aldh. La yqhD cromosomica, che codifica per l’alcol deidrogenasi NADPH-dipendente, è nota per ridurre le aldeidi ai loro alcoli corrispondenti e altamente attiva come meccanismo di disintossicazione . Pertanto, abbiamo eliminato yqhD in JCL299, producendo ceppo ELeco1. Esprimendo la via n-butiraldeide nel ceppo ELeco1, è stata osservata la produzione di n-butiraldeide. Il miglior ceppo ELeco1 / pKU48 / pRW18 / pRW22 ha prodotto 0,16 g / L di n-butirraldeide (Fig. 2 ter). Tuttavia, il rapporto aldeide-alcool era 0,39. Questo basso rapporto aldeide-alcol indica la presenza di altri Adh nativi attivi in grado di ridurre la n-butiraldeide.

Migliorare il rapporto aldeide-alcol eliminando l’alcol nativo deidrogenasi

Per diminuire la formazione di n-butanolo e aumentare il rapporto aldeide-alcol, abbiamo eliminato i geni che codificano per altri Adh nativi. Sulla base di precedenti lavori per la produzione di isobutiraldeide, abbiamo eliminato otto geni adh che possono contribuire alla riduzione della n-butirraldeide: yjgB, fucO, eutG, ybbO, adhP, gldA, yahK e yghA. Questi geni sono stati selezionati perché i loro knockout hanno portato a titoli di produzione più elevati di isobutiraldeide. Abbiamo eliminato sequenzialmente ciascuno di questi geni adh usando la trasduzione del fago P1 con la collezione Keio. Poiché tutti questi geni adh hanno dimostrato di essere efficaci per aumentare la produzione di isobutiraldeide, sono stati eliminati senza un ordine specifico. I risultati dei titoli di produzione di n-butirraldeide e il rapporto aldeide-alcol da questi ceppi mutanti sono mostrati in Fig. 3. Abbiamo notato che i titoli ottenuti da ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22 sono paragonabili a quelli ottenuti dalla domanda di brevetto pubblicata da Easel Biotechnologies , che ha utilizzato un ceppo con genotipo identico. Tuttavia, poiché i titoli n-butanolo non sono stati riportati nel loro lavoro, i rapporti butiraldeide-butanolo non possono essere confrontati. Tuttavia, qui abbiamo preso ulteriormente il design del ceppo e abbiamo dimostrato che ulteriori knockout di geni nativi adh hanno portato a una significativa riduzione del butanolo. Il ceppo finale KS8/pKU48/pRW18/pRW22 ha raggiunto un rapporto aldeide-alcool di 3,1, rappresentando un miglioramento di otto volte rispetto al ceppo ELeco1/pKU48/pRW18 / pRW22. Qui abbiamo notato che il ceppo KS7 che ospita gli stessi plasmidi ha raggiunto un rapporto aldeide-alcool leggermente più alto di 3.4. Tuttavia, la differenza nei rapporti aldeide-alcol era all’interno dell’intervallo di errore e insignificante. Pertanto, il ceppo KS8 è stato utilizzato per esperimenti a valle. Tra gli otto adh aggiuntivi che abbiamo eliminato, eutG, ybbO e yghA non hanno mostrato alcun effetto per aumentare il rapporto aldeide-alcol. Tutti gli altri knock out adh hanno contribuito positivamente ad aumentare il rapporto aldeide-alcol, indicando la loro espressione nativa e la capacità degli enzimi corrispondenti di ridurre la n-butirraldeide. Mentre il rapporto aldeide-alcol è aumentato con ogni knock out del gene adh, il titolo di n-butirraldeide non è aumentato significativamente. Corrispondentemente, anche il consumo di glucosio da parte di ceppi con ogni knock out aggiuntivo del gene adh è diminuito (Fig. 3). Questi risultati indicano che il flusso di carbonio è stato ridotto. L’analisi della termodinamica di ogni fase ha rivelato che la riduzione del butiril-CoA a n-butiraldeide è termodinamicamente sfavorevole con ΔG’° di 7,7 kJ/mol (calcolato utilizzando l’equilibratore ), il che può portare a una conversione inefficiente del butiril-CoA in n-butiraldeide, in particolare dopo che la concentrazione di n-butirraldeide ha raggiunto una certa soglia. È probabile che mentre la produzione di n-butirraldeide è rallentata, anche il metabolismo del glucosio rallenta a causa dell’incapacità per il riciclaggio del NADH. Dal momento che il nativo E. i geni di fermentazione coli (adhE, frdBC e ldhA) sono stati eliminati nel ceppo KS8, la produzione di n-butiraldeide diventa l’unica via fermentativa disponibile per riciclare il NADH in NAD+. Quando la biosintesi della n-butirraldeide viene rallentata, è disponibile meno NAD+ per l’uso nella glicolisi. Di conseguenza, il tasso di consumo di glucosio diminuisce. Pertanto, abbiamo successivamente studiato l’effetto della rimozione in situ sul titolo di produzione di n-butirraldeide.

Miglioramento del titolo di n-butirraldeide mediante rimozione del prodotto in situ

Qui abbiamo scelto di utilizzare l’estrazione liquido–liquido in situ per la rimozione di n-butirraldeide utilizzando la sovrapposizione organica. Dodecano e alcol oleilico sono stati selezionati come estrattivi a causa della loro applicazione generale e non tossicità alle colture microbiche . Abbiamo determinato il coefficiente di ripartizione di n-butirraldeide in acqua e nei due solventi organici misurando il rapporto di n-butirraldeide che appare sia in fase acquosa che organica (File aggiuntivo 1: Figura S2) dopo una vigorosa miscelazione seguita da incubazione stazionaria a 37 °C. Il coefficiente di ripartizione determinato per n-butirraldeide era 0,141 e 0,764 per dodecano e Questo risultato ha indicato che l’alcol oleilico può essere un estrattore più adatto per la n-butiraldeide poiché un coefficiente di ripartizione più elevato indica il rapporto più elevato di n-butiraldeide trovato nello strato organico. Questi due estrattivi sono solo leggermente tossici per E. coli poiché la crescita del ceppo produttore di n-butirraldeide coltivato in presenza di dodecano o alcool oleilico è stata solo leggermente ridotta rispetto al controllo senza alcun estrattore (Fig. 4a), indicando l’idoneità di questi solventi per l’estrazione in situ. Come risultati mostrati in Fig. 4b, titolo n-butirraldeide significativamente migliorato in presenza di estrattore. Coerentemente sia per il dodecano che per l’alcool oleilico, utilizzando 1 volume di estrattore supera quello utilizzando 0,5 volume. La migliore condizione utilizzando alcol oleilico con un rapporto di volume estrattivo-coltura 1:1 ha prodotto oltre 0,6 g / L di n-butirraldeide, rappresentando un miglioramento quasi triplo rispetto a nessun estrattore. Come previsto, l’alcol oleilico ha sovraperformato il dodecano come estrattore per la n-butirraldeide (Fig. 4c), coerente con i coefficienti di partizione.

Effetto della riduzione della complessità dei media sulla produzione di n-butiraldeide

Successivamente, abbiamo valutato l’effetto dell’estratto di lievito e della concentrazione di triptone sulla produzione di n-butiraldeide. Utilizzando terrific brodo (TB) non è in genere commercialmente praticabile a causa del suo costo costoso. Inoltre, le aldeidi sono reattive e possono formare spontaneamente la base di Schiff con le ammine. Poiché TB contiene elevate quantità di estratto di lievito e triptone, aldeidi possono probabilmente essere spontaneamente reagito con i gruppi amminici presenti su aminoacidi e oligopeptidi in TB. Utilizzando M9 media con glucosio come base, integriamo 0 a 2% estratto di lievito o triptone per determinare un livello ottimale. I risultati sono riassunti in Fig. 5. La figura 5a mostra l’effetto della concentrazione dell’estratto di lievito sulla produzione di n-butirraldeide dopo 24 ore di incubazione anaerobica. il titolo di n-butirraldeide non era significativamente sensibile alla concentrazione di estratto di lievito tra 0,125 e 2%. Tuttavia, se non è stato aggiunto estratto di lievito, è stata osservata solo una minima quantità di n-butiraldeide, indicando l’importanza della fonte di azoto complessa. È interessante notare che quelli che utilizzavano M9 con estratto di lievito avevano un rapporto aldeide-alcol più elevato rispetto a quello che utilizzava TB a causa di livelli più elevati di butanolo prodotto. 48-h interruttore post-anaerobico (Fig. 5b) ha mostrato una leggera diminuzione della n-butiraldeide e un aumento del titolo di n-butanolo, indicando che l’alcol deidrogenasi funzionale converte attivamente la n-butiraldeide in n-butanolo.

la produzione di n-butirraldeide era più sensibile alla concentrazione di triptoni rispetto a quella dell’estratto di lievito come colture contenenti 0,125 e 0.il 25% di triptone ha mostrato un titolo di n-butirraldeide inferiore rispetto alle corrispondenti concentrazioni di estratto di lievito (Fig. 5 quater, d). L’aumento della concentrazione di triptone ha portato ad un aumento della produzione di n-butanolo, indicando che il triptone ha contribuito alla riduzione del rapporto aldeide-alcool per l’utilizzo della TB come mezzo di produzione. Confrontando i componenti dell’estratto di lievito e del triptone dal manuale dei produttori, abbiamo notato che il triptone ha una percentuale più elevata di molecole più grandi con peso molecolare nell’intervallo di 500-2000 Da, indicando una maggiore quantità di oligopeptidi. D’altra parte, l’estratto di lievito contiene principalmente molecole più piccole con peso molecolare inferiore a 250 Da. È possibile che questa discrepanza abbia portato a diversi modelli di espressione che possono includere alcol deidrogenasi nativo non specifico in grado di ridurre la n-butirraldeide. Tuttavia, il meccanismo esatto per cui il triptone causa un aumento della produzione di n-butanolo non è chiaro.