大腸菌によるグルコースからのn-ブチルアルデヒドの再生可能な合成

N-ブチルアルデヒド生産のためのCoAアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼの選択

N-ブチルアルデヒドは、クロストリジウムCoA依存性n-ブタノール生産経路の中間体である。 1b)。 しかし、二官能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼAdhe2は、生成物としてn-ブチルアルデヒドをバイパスして、ブチリル-CoAのn-ブタノールへの直接二段階変換を触媒する。 N-ブチルアルデヒドのn-ブタノールへの変換を避けるために,まずAdhe2をCoa-アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ(Aldh)に置き換え,ブチリル-Coaのn-ブチルアルデヒドへの変換のみを触媒した。 Clostridium beijerinckiiのようないくつかのクロストリジウムは、ブタノール生産のための二官能性酵素の代わりに、個々のAldhとAdhを含む。 また、Aldhはethanolamineおよび1,3-propanediolのための低下の細道にあります。 しかし、エタノールアミンと1,3-プロパンジオールの利用オペロンからのAldhはブチリルCoA還元に特異的ではなく、大腸菌で発現するとエタノールを産生することが以前に示されている。 したがって、本研究では、Clostridium Aldhを使用することを選択しました。 C.beijerinckiiからのaldhの配列に基づいて、我々はC.saccharolyticumとC.saccharoperbutylacetonicumから二つの追加の同族体だけでなく、我々は我々の研究室で以前に単離したC.beijerinckiiから変異aldhを選択しました(その配列 これらの4つのaldh遺伝子は、アセチルCoAをブチリルCoAに変換するのに必要な遺伝子を有する合成オペロンに個別にクローニングされた(図1)。 1b)。 これらの合成オペロンは、以前にIPTG誘導Pllaco1プロモーターを使用すると比較してブタノールの高い力価を生成することが示されているackとadhE遺伝子、PackとPadhE、そ ここで、PackおよびPadheは、リボソーム結合部位およびそれらの対応する遺伝子の上流の5’非翻訳領域を含むように定義された。 atoB、aldh、crt、およびhbdは、Packの制御下でcole1起源プラスミド上の一つのオペロンとしてクローニングされました。 terおよびfdhは、padheの制御下で、それぞれ、colAおよびpsc101起源プラスミド上で個別に発現した。 これらのプラスミドは、以前に効率的にn-ブタノールを産生することが示され、ldhA、adhE、frdBC、およびptaがノックアウトされた大腸菌株JCL299に形質転換された。 混合酸発酵経路をノックアウトしたJCL299は、n-ブチルアルデヒドの合成のためにアセチルCoAおよびNADHを効率的にチャネルする。 予想されるように、内因性アルコールデヒドロゲナーゼの存在のために、得られた株は、n-ブチルアルデヒドの最小の産生を示した(図。 2a)。 発酵生成物の大部分は、四つの異なるaldh遺伝子を発現する株全体でn-ブタノールであった。 NADPH依存性アルコールデヒドロゲナーゼをコードする染色体yqhdは,アルデヒドを対応するアルコールに還元することが知られており,解毒機構として非常に活性である。 したがって、我々は株Eleco1をもたらし、JCL299でyqhDをノックアウトしました。 株Eleco1におけるn-ブチルアルデヒド経路を発現し、n-ブチルアルデヒド産生が観察された。 最良のEleco1/PKU4 8/PRW1 8/PRW2 2株は、0.1 6g/Lのn−ブチルアルデヒドを生成した(図1 0A)。 2b)。 しかし、アルデヒド対アルコール比は0.39であった。 この低いアルデヒド対アルコール比は、n-ブチルアルデヒドを還元することができる他の活性天然Adhの存在を示す。

図1.1.1. 2
図2

CoA依存性経路を有する異なるAldhを発現するa JCL299およびb Eleco1株によるブチルアルデヒド、ブタノール、およびそれらの比率の生産。 CB、C. cs(N1−4)、C.saccharobutylicum;Cs(N1−4)、C.saccharoperbutylacetonicum N1−4;Buald,n−ブチルアルデヒド;Buoh,n−ブタノールからの変異体Aldh。 誤差バーは、3つの実験の標準偏差を表します

天然アルコールデヒドロゲナーゼ

をノックアウトしてn-ブタノール形成を減少させ、アルデヒド-アルコール比を増加させることにより、他の天然Adhをコードする遺伝子をノックアウトした。 イソブチルアルデヒド産生のための以前の研究に基づいて、我々は、n-ブチルアルデヒドの減少に寄与する可能性が高い八adh遺伝子を削除しました:yjgB、fucO、eutG、ybbO、adhP、gldA、yahK、 これらの遺伝子は、それらのノックアウトがイソブチルアルデヒドのより高い生産力価につながったために選択された。 慶應コレクションでP1ファージ形質導入を用いて、これらのadh遺伝子のそれぞれを順次ノックアウトしました。 これらのadh遺伝子は全てイソブチルアルデヒド産生を増加させるのに有効であることが示されているので,特定の順序なしにノックアウトされた。 これらの変異株からのn−ブチルアルデヒド産生力価およびアルデヒド−アルコール比の結果を図1に示す。 3. 本発明者らは、Eleco1/PKU4 8/PRW1 8/PRW2 2によって達成される力価は、同一の遺伝子型を有する株を使用したEasel Biotechnologiesからの公開された特許出願によって達成される しかし、n-ブタノール力価は彼らの仕事で報告されていなかったので、ブチルアルデヒド-ブタノール比を比較することはできません。 それにもかかわらず、ここで我々はさらに株の設計を取り、ネイティブadh遺伝子の追加のノックアウトがブタノールの有意な減少につながったことを示 最終ひずみKS8/pku48/prw18/prw22は3.1のアルデヒド-アルコール比に達し、ひずみEleco1/pku48/prw18/prw22と比較して八倍の改善を表しています。 ここでは、同じプラスミドを保有する株KS7は3.4のわずかに高いアルデヒド-アルコール比に達したことに留意した。 しかし,アルデヒド対アルコール比の差は誤差範囲内であり,重要ではなかった。 したがって、ひずみKS8は、下流の実験のために使用されました。 ノックアウトしたadhのうち,eutg,ybbo,yghaはアルデヒド対アルコール比を増加させる効果を示さなかった。 他のすべてのadhノックアウトは、それらのネイティブの発現とn-ブチルアルデヒドを減少させる対応する酵素の能力を示す、アルデヒド-アルコール比を増加させる方に積極的に貢献した。 アルデヒド対アルコール比は各adh遺伝子ノックアウトとともに増加したが,n-ブチルアルデヒドの力価は有意に増加しなかった。 これに対応して、各追加のad H遺伝子ノックアウトを有する株によるグルコース消費もまた減少した(図1)。 3). これらの結果は,炭素フラックスが減少したことを示している。 各ステップの熱力学の分析は、N-ブチルアルデヒドへのブチリル-CoAの還元が熱力学的に好ましくないことを明らかにしたΔ G’°7.7kJ/mol(平衡器を用いて計算)、特にn-ブチルアルデヒド濃度が一定のしきい値に達した後、ブチリル-CoAのn-ブチルアルデヒドへの非効率的な変換につながる可能性がある。 N-ブチルアルデヒド産生が遅くなると、グルコース代謝もNADHリサイクルができないために遅くなる可能性があります。 ネイティブE以来。 大腸菌の発酵の遺伝子(adhE、frdBCおよびldhA)は緊張KS8でノックアウトされました、n-ブチルアルデヒドの生産はNADHをNAD+に戻すために利用できる唯一の発酵 N-ブチルアルデヒド生合成が遅くなると、解糖に使用するためにNAD+が少なくなります。 その結果、グルコース消費率が低下する。 そこで,n-ブチルアルデヒド産生力価に及ぼすinsitu除去の影響を調べた。

図1.1.1. 3
図3

アルコールデヒドロゲナーゼと異なる株によるn-ブチルアルデヒド生産とグルコース消費は24hでノックアウトします。 完全な株およびプラスミドのリストについては、表1を参照してください。 表中の三角形は遺伝子ノックアウトを示す。 誤差バーは、3つの実験の標準偏差を表します

in situ生成物除去によるn-ブチルアルデヒド力価の改善

ここでは、有機オーバーレイを用いたn–ブチルアルデヒド除去にin situ液液抽出を使用すること ドデカンとオレイルアルコールは,微生物培養に対する一般的な適用と非毒性のために抽出剤として選択された。 我々は、水と有機相の両方に現れるn-ブチルアルデヒドの比を測定することによって、水と二つの有機溶媒中のn-ブチルアルデヒドの分配係数を決定した(追加ファイル1:図S2)37℃での静止インキュベーションに続いて激しい混合後。n-ブチルアルデヒドの決定された分配係数は、それぞれドデカンとオレイルアルコールの0.141と0.764であった。 この結果から,オレイルアルコールはn-ブチルアルデヒドに対してより適した抽出剤であり,分配係数が高いほど有機層に見られるn-ブチルアルデヒドの比率が高いことを示した。 これら二つの抽出剤は、ドデカンまたはオレイルアルコールのいずれかの存在下で栽培されたn-ブチルアルデヒド産生株の成長が抽出剤なしの対照と比較してわずかに低下したため、大腸菌に対して軽度に毒性があるだけである(図。 これらの溶媒のin situ抽出のための適合性を示す図4A)を示す。 結果を図に示すように。 4b、n-ブチルアルデヒド力価は、抽出剤の存在下で有意に改善された。 ドデカンとオレイルアルコールの両方で一貫して、1体積の抽出剤を使用すると、0.5体積の抽出剤を使用するよりも優れています。 1:1抽出剤-培養体積比とオレイルアルコールを使用した最良の条件は、n-ブチルアルデヒドの0.6g/L以上を生成し、抽出剤なしでほぼ三倍の改善を表 予想されるように、オレイルアルコールは、n-ブチルアルデヒドの抽出剤としてドデカンを上回った(図。 図4c)に示すように、分配係数と一致する。

図1.1.1. 4
図4

in situ生成物除去のための二相抽出を用いたn-ブチルアルデヒド生成。 抽出剤ドデカンとオレイルアルコールオーバーレイを用いた培地中での細胞増殖。 異なった抽出剤を使用してbの総n-ブチルアルデヒドの力価。 48-hサンプルの培養培地(水相)および抽出剤(有機相)中のc n-ブチリーアルデヒド分布。 抽出剤のTBに対する比率は、添加された抽出剤の体積を2 0mLの培養物(2%グルコースを含むTB)で割ったものとして定義される。 誤差バーは、3回の実験の標準偏差を表します

n-ブチルアルデヒド生産に及ぼす培地の複雑さを低減する効果

次に、n-ブチルアルデヒド生産に及ぼす酵母抽出物とトリプトン濃度の影響を評価した。 Terrificブロス(TB)を使用することは、その高価なコストのために一般的に商業的に実行可能ではありません。 さらに、アルデヒドは反応性であり、自発的にアミンとシッフ塩基を形成することができる。 TBは酵母エキスとトリプトンを多量に含むので、アルデヒドはTBのアミノ酸とオリゴペプチド上に存在するアミノ酸基と自発的に反応する可能性が グルコースをベースとしたM9培地を使用して、最適なレベルを決定するために0-2%の酵母抽出物またはトリプトンを補充する。 その結果を図1に要約する。 5. 図5aは、嫌気性インキュベーションの24時間後のn-ブチルアルデヒドの生産に及ぼす酵母抽出物濃度の影響を示しています。 n-ブチルアルデヒド力価は、0.125と2%の間の酵母抽出物濃度に有意に敏感ではなかった。 しかし,酵母抽出物を添加しなかった場合,n-ブチルアルデヒドの最小量のみが観察され,複雑な窒素源の重要性を示した。 興味深いことに、酵母抽出物とM9を使用したものは、生産されたブタノールのレベルが高いため、TBを使用したものよりも高いアルデヒド対アルコール比 48-h後嫌気性スイッチ(Fig. 5b)はn-ブチルアルデヒドのわずかな減少とn-ブタノール力価の増加を示し、機能性アルコールデヒドロゲナーゼがn-ブチルアルデヒドをn-ブタノールに積極的に変換することを示した。

図1.1.1. 5
図5

n-ブチルアルデヒド産生のためのm9グルコース培地中の酵母抽出物(a、b)とトリプトン(c、d)濃度の比較。 A、c24hおよびb、d48-hでサンプリングされた生成物濃度およびブチルアルデヒド対ブタノール比は、嫌気性条件に切り替えた後に採取される。 株KS8/pku48/prw18/prw22は、n-ブチルアルデヒド生産のために使用されました

n-ブチルアルデヒド産生は、0.125および0を含む培養物として酵母抽出物のそれよりもトリプトン濃度に敏感であった。25%のトリプトンは、酵母抽出物の対応する濃度と比較して低いn-ブチルアルデヒド力価を示した(図。 5c、d)。 トリプトン濃度の増加はn-ブタノール生産の増加をもたらし,トリプトンはTBを生産培地として使用するためのアルデヒド-アルコール比の低下に寄与した。 酵母エキスとトリプトーンの成分をメーカーのマニュアルから比較することにより、トリプトーンは500-2000Da以上の範囲の分子量を持つ大きな分子の割合が高いことに気づき、オリゴペプチドの量が多いことを示した。 一方、酵母抽出物は、分子量が250Da未満の主に小さい分子を含む。 この不一致は、n-ブチルアルデヒドを減少させることができる非特異的な天然アルコールデヒドロゲナーゼを含む可能性がある異なる発現パターンにつ それにもかかわらず、トリプトンがn-ブタノール生産の増加を引き起こす理由の正確なメカニズムは不明である。