설계 대장균에 의한 포도당으로부터 엔-부티르알데히드의 재생 가능한 합성

엔-부티르알데히드 생산을 위한 코아-아실화 알데히드 탈수소 효소의 선택

엔-부티르알데히드는 클로스트리듐 코아 의존적 엔-부탄올 생산 경로의 중간체이다(그림 1). 1 비). 그러나,이 기능성 알데히드/알코올 탈수소 효소 아데 2 는 부티릴-코아를 엔-부탄올로의 직접적인 2 단계 전환을 촉매하여 엔-부티르알데히드를 생성물로서 우회한다. 피 변환 n-부틸 알데히드하는 n-butanol,우리는 먼저 교체 AdhE2CoA-acylating 알데하이드 dehydrogenase(Aldh),촉매뿐만 아니라 변환 butyryl-CoA n-부틸 알데히드. 다음과 같은 일부 클로스 트리 디아 클로스 트리 디움 베이 제린 키 부탄올 생산을위한 이중 기능 효소 대신 개별 알드와 아드를 포함합니다. 대안 적으로,알드는 에탄올 아민 및 1,3-프로판 디올에 대한 분해 경로에서 발견된다. 그러나,에탄올 아민 및 1,3-프로판 디올 이용 오페론으로부터의 알드는 부티릴-코아 환원에 특이적이지 않으며,이전에 대장균으로 발현될 때 에탄올을 생성하는 것으로 나타났다. 따라서 현재의 연구를 위해 우리는 클로스 트리 디움 알드와 함께 일하기로 결정했습니다. 본 연구실에서는 연구실에서 분리한 돌연변이 알드뿐만 아니라,사카롤리티쿰과 사카로페르부틸아세토니쿰으로부터 2 개의 추가 동족체를 선택하였다(서열은 추가 파일 1 참조). 이 4 개의 알드 유전자를 아세틸-코아를 부티릴-코아로 전환시키는 데 필요한 유전자를 가진 합성 오페론으로 개별적으로 복제 하였다(그림 1). 1 비). 이러한 합성 오페론은 각각 에이크 및 고착 유전자,팩 및 파데의 네이티브 대장균 프로모터에 의해 구동되었으며,이는 이전에 유도 성 플라 코 1 프로모터를 사용하는 것에 비해 부탄올의 높은 역가를 생성하는 것으로 나타났습니다. 여기 팩 및 파 데 리보솜 바인딩 사이트 및 5’그들의 해당 유전자의 상류 번역 되지 않은 영역을 포함 하도록 정의 했다. 팩의 제어하에 콜 1 기원 플라스미드에 하나의 오페론으로 복제되었다. 101 원산지 플라스미드,각각,파데의 통제하에. 이러한 플라스미드는 대장균 균주로 변형되어 이전에 부탄올을 효율적으로 생산하는 것으로 나타났습니다. 아세틸코아 및 아세틸코아 합성을 위해 아세틸코아 및 아세틸코아 합성을 효율적으로 유도한다. 예상 한 바와 같이,내인성 알코올 탈수소 효소의 존재로 인해,생성 된 균주는 엔-부티르알데히드(그림 2)의 최소 생산을 보였다. 2 에이). 발효 제품의 대부분은 4 개의 다른 알드 유전자를 발현하는 균주에 걸쳐 엔-부탄올이었다. 탈수소 효소에 대한 코딩,알데히드를 해당 알코올로 감소시키는 것으로 알려져 있으며 해독 메커니즘으로 매우 활동적입니다. 따라서,우리는 기절하겠지에 JCL299 산출,변형 ELeco1. 균주 전기 1 에서 엔-부티르알데히드 경로를 표현함으로써,엔-부티르알데히드 생산이 관찰되었다. 최고의 스트레인 ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22 생산 0.16g/L n-부틸 알데히드(그림. 2 비). 그러나 알데히드 대 알코올 비율은 0.39 였다. 이 낮은 알데히드 대 알코올 비율은 엔-부티르알데히드를 환원시킬 수 있는 다른 활성 토착 아드의 존재를 나타낸다.

알데하이드-대-알코올 비율 개선 네이티브 알코올 탈수소 효소를 노크하여

엔-부탄올 형성을 감소시키고 알데히드-대-알코올 비율을 증가시키기 위해,우리는 다른 네이티브 아드 에이즈에 대한 코딩 유전자를 기절시켰다. 이소부티르알데히드 생산에 대한 이전 연구를 바탕으로,우리는 부티르알데히드 환원에 기여할 수 있는 8 개의 유전자를 삭제했다. 이 유전자는 녹아웃이 이소 부티르 알데히드의 높은 생산 역가를 가져 왔기 때문에 선택되었습니다. 우리는 순차적으로 게이오 컬렉션 파지 전달을 사용 하 여 이러한 유전자의 각 기 절. 이들 유전자는 모두 이소부티르알데히드 생산을 증가시키는 데 효과적인 것으로 밝혀졌으므로,특정한 순서 없이 기절되었다. 이러한 돌연변이 균주로부터의 엔-부티르알데히드 생산 역가 및 알데히드-대-알코올 비율의 결과는 도 1 에 도시되어있다. 3. 우리는 이젤생명공학에서 발표된 특허출원과 동일한 유전자형을 가진 균주를 사용한 역가와 비교할 수 있다고 지적했다. 그러나,엔-부탄올 역가가 그들의 작업에서보고되지 않았기 때문에,부티르알데히드-대-부탄올 비율은 비교 될 수 없다. 그럼에도 불구 하 고,여기 우리가 더 변형 디자인을 했다 하 고 네이티브 아드 유전자의 추가 녹아웃 부탄올에 상당한 감소를 주도 했다. 본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 여기서 우리는 동일한 플라스미드를 함유 한 균주가 3.4 의 약간 높은 알데히드 대 알코올 비율에 도달했다고 지적했다. 그러나 알데히드 대 알코올 비율의 차이는 오차 범위 내에서 중요하지 않았습니다. 따라서,스트레인 케이에스 8 은 다운스트림 실험에 사용되었다. 우리가 기절시킨 8 개의 추가 아드 아드 중,아드 아드,이보 및 이가는 알데히드 대 알코올 비율을 증가시키는 데 아무런 영향을 미치지 않았습니다. 다른 모든 에이드 녹아웃은 알데히드 대 알코올 비율을 증가시키는 데 긍정적으로 기여하여 고유 한 발현과 해당 효소의 감소 능력을 나타냅니다 엔-부티르 알데히드. 알데하이드-대-알코올 비율은 각각의 유전자와 함께 증가하는 동안 녹아웃,엔-부티르알데히드의 역가는 크게 증가하지 않았다. 이에 대응하여,각각의 추가 유전자와 균주에 의한 포도당 소비도 감소 녹아웃(그림. 3). 이러한 결과는 탄소 플럭스가 감소되었음을 나타냅니다. 각 단계의 열역학을 분석 한 결과,부티릴-코아 환원이 엔-부티르알데히드로의 열역학적으로 불리하다는 것이 밝혀졌으며,이는 특히 엔-부티르알데히드 농도가 특정 임계 값에 도달 한 후에 부티릴-코아의 엔-부티르알데히드로의 비효율적 인 전환을 초래할 수있다. 그것은 가능성이 그 엔-부 티르 알데히드 생산 둔화,포도 당 대사 또한 느려 나 드 재활용에 대 한 무 능력으로 인해. 네이티브 전자 이후. 대장균 발효작용 유전자(adhE,frdBC 및 ldhA)되었습에서 기절 스트레인 KS8,n-티르는 생산 된 유효 통로 사용할 수 있 재활용 NADH 다시 나트+. 때 엔-부티르알데히드 생합성 감속,덜 나드+해당 과정에 사용할 수 있습니다. 그 결과 포도당 소비율이 감소합니다. 따라서,우리는 다음에 현장 제거의 효과 조사 엔-부 티르 알데히드 생산 역가.

개선 엔-부티르 알데히드 역가 제자리 제품 제거에 의한

여기서 우리는 유기 오버레이를 사용하여 엔–부티르 알데히드 제거를 위해 현장 액체-액체 추출을 사용하기로 결정했습니다. 도데 칸 및 올레 일 알코올은 미생물 배양에 대한 일반적인 적용 및 비 독성 때문에 추출제로 선택되었습니다. (추가 파일 1:그림 에스 2)활발한 혼합 후 37 에서 고정 배양 물.엔-부티르알데히드에 대 한 결정 된 파티션 계수 엔-부티르알데히드 물 및 두 유기 용 매에서 나타나는 엔-부티르알데히드의 비율을 측정 하 여 결정 했다 37:그림 에스 2)에서 고정 배양 물.엔-부티르알데히드에 대 한 결정 된 파티션 계수 0.141 및 0.764 도 데 칸 및 올레일 알코올,각각. 이 결과는 올레일 알코올이 더 높은 칸막이 계수가 유기층에서 발견되는 더 높은 비율의 엔-부티르알데히드를 나타내므로 엔-부티르알데히드에 더 적합한 추출제일 수 있음을 나타내었다. 이 두 추출제는 도데칸 또는 올레일 알코올의 존재 하에서 배양된 엔-부티르알데히드 생성 균주의 성장이 어떠한 추출제 없이 대조군에 비해 단지 약간 저하되었기 때문에 대장균에 대해 단지 약간 독성이 있다(그림 1). 4 에이),현장 추출에 대한 이러한 용매의 적합성을 나타내는. 결과는 도에 도시 된 바와 같이. 4 비,엔-부티르알데히드 역가는 추출물의 존재 하에서 현저하게 개선되었다. 일관되게 도데 칸과 올레 일 알코올 모두에 대해 1 부피의 추출물을 사용하면 0.5 부피를 사용하는 것보다 성능이 뛰어납니다. 1:1 추출제 대 배양 부피비를 가진 올레 일 알콜을 사용하는 최상의 조건은 0.6 그램/리터의 엔-부티르알데히드에 걸쳐 생성되어 추출제가없는 것보다 거의 3 배 개선되었습니다. 예상 한 바와 같이,올레 일 알코올은 엔-부티르 알데히드(그림 1)에 대한 추출제로서 도데 칸을 능가했다. 4 기음),파티션 계수와 일치.

엔-부티르알데히드 생산에 미디어 복잡성을 줄이는 효과

다음으로,우리는 엔-부티르알데히드 생산에 효 모 추출 물 및 트립 톤 농도의 효과 평가. 훌륭한 국물(결핵)을 사용하는 것은 일반적으로 비싼 비용으로 인해 상업적으로 실행 가능하지 않습니다. 또한 알데히드는 반응성이 있으며 자발적으로 아민으로 쉬프 염기를 형성 할 수 있습니다. 결핵은 다량의 효모 추출물과 트립톤을 함유하고 있기 때문에 알데히드는 결핵의 아미노산 및 올리고 펩타이드에 존재하는 아미노기와 자발적으로 반응 할 수 있습니다. 포도당을 기본으로 삼아 0~2%의 효모 추출물 또는 트립톤을 보충하여 최적의 수준을 결정합니다. 결과는 그림 1 에 요약되어 있습니다. 5. 그림 5 에이 24 시간의 혐기성 배양 후 효모 추출물 농도가 엔-부티르알데히드의 생산에 미치는 영향을 보여줍니다. 엔-부티르알데히드 역가는 0.125 내지 2%사이의 효모 추출물 농도에 유의하게 민감하지 않았다. 그러나 효모 추출물이 첨가되지 않은 경우 최소량의 엔-부티르알데히드 만 관찰되어 복잡한 질소 공급원의 중요성을 나타냅니다. 흥미롭게도,효모 추출물과 함께 미디엄 9 를 사용하는 사람들은 부탄올 생산 수준이 높기 때문에 결핵을 사용하는 것보다 알데히드 대 알코올 비율이 더 높았다. 48 시간 후 혐기성 스위치(그림. 5 비)엔-부티르 알데히드의 약간의 감소와 엔-부탄올 역가의 증가를 보였으며,기능성 알코올 탈수소 효소가 엔-부티르 알데히드를 엔-부탄올로 적극적으로 전환시키는 것을 나타낸다.

엔-부티르알데히드 생산은 0.125 및 0 을 포함하는 배양물로서 효모 추출물의 농도보다 트립톤 농도에 더 민감하였다.25%트립톤은 해당 농도의 효모 추출물에 비해 엔-부티르알데히드 역가가 더 낮았다(그림 1). 5 기음,디). 트립톤 농도가 증가하면 엔-부탄올 생산이 증가하여 트립톤이 결핵을 생산 매체로 사용하기 위해 알데히드 대 알코올 비율이 낮아지는 데 기여했음을 나타냅니다. 제조업체 매뉴얼의 효모 추출물과 트립톤의 성분을 비교함으로써,트립톤은 분자량이 500-2000 다보다 큰 분자의 비율이 높다는 것을 알았고,이는 더 많은 양의 올리고 펩타이드를 나타냅니다. 다른 한편으로,효 모 추출 물 분자 무게 미만 250 다 주로 작은 분자를 포함 합니다. 이러한 불일치가 엔-부티르알데히드를 환원시킬 수 있는 비특이적 네이티브 알코올 탈수소 효소를 포함할 수 있는 상이한 발현 패턴을 초래했을 가능성이 있다. 그럼에도 불구하고,트립 톤이 엔-부탄올 생산의 증가를 일으키는 이유에 대한 정확한 메커니즘은 불분명하다.