Fornybar syntese av n-butyraldehyd fra glukose ved konstruert Escherichia coli

Utvalg Av CoA-acylerende aldehyd dehydrogenase for n-butyraldehydproduksjon

n-Butyraldehyd er et mellomprodukt i Clostridium CoA-avhengig n-butanol produksjonsvei (Fig. 1b). Bifunksjonelt aldehyd / alkohol dehydrogenase AdhE2 katalyserer imidlertid direkte to-trinns konvertering av butyryl-CoA til n-butanol, omgå n-butyraldehyd som et produkt. For å unngå konvertering av n-butyraldehyd til n-butanol, erstattet Vi Først AdhE2 med CoA-acylerende aldehyd dehydrogenase (Aldh), som katalyserer bare omdannelsen av butyryl-CoA til n-butyraldehyd. Noen Clostridia som clostridium beijerinckii inneholder individuell Aldh og Adh i stedet for et bifunksjonelt enzym for butanolproduksjon. Alternativt finnes Aldh i nedbrytningsveiene for etanolamin og 1,3-propandiol . Aldh fra etanolamin og 1,3-propandiol utnyttelsesoperoner er imidlertid ikke spesifikke for butyryl-CoA-reduksjon og har tidligere vist seg å produsere etanol når det uttrykkes I E. coli . Derfor valgte vi for denne studien Å jobbe med Clostridium Aldh. Basert på sekvensen av aldh fra c. beijerinckii valgte vi to ekstra homologer Fra C. saccharolyticum og C. saccharoperbutylacetonicum, samt en mutant aldh fra c. beijerinckii som vi isolerte tidligere i vårt laboratorium (se Tilleggsfil 1 for sin sekvens). Disse fire aldh-genene ble individuelt klonet til syntetiske operoner med genene som var nødvendige for å konvertere acetyl-CoA til butyryl-CoA (Fig. 1b). Disse syntetiske operonene ble drevet av naturlig e. coli-promotor av ack-og adhE-gener, Henholdsvis Pack og PadhE, som tidligere har vist seg å produsere høyere titere butanol sammenlignet med Bruk Av Iptg-inducerbar PLlacO1-promotor . Her Ble Pakningen og PadhE definert til å inkludere det ribosomale bindingsstedet og 5 ‘ uoversatt region oppstrøms deres tilsvarende gener. atob, aldh, crt, og hbd ble klonet som en operon på en colE1 opprinnelse plasmid under kontroll Av Pack. ter og fdh ble individuelt uttrykt på henholdsvis colA og pSC101 opprinnelsesplasmider, under Kontroll av PadhE . Disse plasmider ble omdannet Til e. coli stamme JCL299 som tidligere ble vist å effektivt produsere n-butanol og har ldhA, adhE, frdBC, og pta slått ut . ETTER å ha slått ut de blandede syrefermenteringsbanene, kan JCL299 effektivt acetyl-CoA og NADH for syntese av n-butyraldehyd. Som forventet, på grunn av tilstedeværelsen av endogene alkoholdehydrogenaser, viste de resulterende stammene minimal produksjon av n-butyraldehyd(Fig. 2a). Flertallet av fermenteringsproduktene var n-butanol over stammene som uttrykte de fire forskjellige aldh-gener. Kromosomal yqhD, som koder FOR NADPH-avhengig alkoholdehydrogenase, er kjent for å redusere aldehyder til deres tilsvarende alkoholer og svært aktiv som en avgiftningsmekanisme . Derfor slo vi ut yqhD I JCL299, noe som ga stamme ELeco1. Ved å uttrykke n-butyraldehydveien i stamme ELeco1 ble n-butyraldehydproduksjon observert. Den beste stammen ELeco1 / pKU48 / pRW18 / pRW22 produserte 0,16 g/L n-butyraldehyd (Fig. 2b). Aldehyd-til-alkohol-forholdet var imidlertid 0,39. Dette lave aldehyd-til-alkoholforholdet indikerer tilstedeværelsen av andre aktive native Adh som er i stand til å redusere n-butyraldehyd.

Forbedring av aldehyd-til-alkohol-forholdet ved å slå ut innfødte alkoholdehydrogenaser

for å redusere n-butanoldannelse Og øke aldehyd-til-alkohol-forholdet, slo vi ut gener som koder for andre innfødte Adh. Basert på tidligere arbeid for produksjon av isobutyraldehyd , slettet vi åtte adh-gener som sannsynligvis vil bidra til reduksjon av n-butyraldehyd: yjgb, fucO, eutg, ybbO, adhP, gldA, yahK og yghA. Disse genene ble valgt fordi deres knockouts førte til høyere produksjonstitere av isobutyraldehyd. Vi slått sekvensielt ut hvert av disse adh-genene ved Hjelp Av P1 fagtransduksjon med Keio-samlingen. Siden alle disse adh-genene har vist seg å være effektive for å øke isobutyraldehydproduksjonen, ble de slått ut uten spesifikk rekkefølge. Resultatene av n-butyraldehydproduksjonstitere og aldehyd-til-alkoholforholdet fra disse mutantstammene er vist I Fig. 3. Vi bemerket at titrene oppnådd Av ELeco1 / pKU48 / pRW18 / pRW22 er sammenlignbare med de som oppnås ved den publiserte patentsøknaden Fra Easel Biotechnologies, som brukte en stamme med identisk genotype. Men fordi n-butanol-titrene ikke ble rapportert i deres arbeid, kan butyraldehyd-til-butanol-forholdene ikke sammenlignes. Likevel, her tok vi stammedesignet videre og viste at ytterligere knockouts av innfødte adh-gener førte til betydelig reduksjon i butanol. Den endelige stamme KS8 / pKU48 / pRW18 / pRW22 nådde et aldehyd-til-alkohol-forhold på 3,1, som representerer en åttedoblet forbedring sammenlignet med stamme ELeco1 / pKU48/pRW18 / pRW22. Her bemerket vi at stamme KS7 husing de samme plasmider nådd noe høyere aldehyd-til-alkohol-forhold på 3,4. Forskjellen i aldehyd-til-alkohol-forhold var imidlertid innenfor feilområde og ubetydelig. Derfor ble stamme KS8 brukt til nedstrøms eksperimenter. Blant de åtte ekstra adh som vi slått ut, eutG, ybbO, og yghA viste ingen effekt for å øke aldehyd-til-alkohol ratio. Alle andre adh knock out bidro positivt til å øke aldehyd-til-alkohol-forholdet, noe som indikerer deres opprinnelige uttrykk og tilsvarende enzymers evne til å redusere n-butyraldehyd. Mens aldehyd-til-alkohol-forholdet økte med hvert adh-genutslag, økte titer av n-butyraldehyd ikke signifikant. Tilsvarende ble glukoseforbruket av stammer med hvert ekstra adh-genutslag også redusert (Fig . 3). Disse resultatene indikerer at karbonfluxen ble redusert. Analyse av termodynamikken i hvert trinn viste at butyryl-CoA-reduksjon til n-butyraldehyd er termodynamisk ugunstig med Δ ‘ ° på 7,7 kJ / mol (beregnet ved hjelp av eQuilibrator), noe som kan føre til ineffektiv konvertering av butyryl-CoA til n-butyraldehyd, spesielt etter at n-butyraldehydkonsentrasjonen nådde en viss terskel. Det er sannsynlig at når n-butyraldehydproduksjonen reduseres, reduseres glukosemetabolismen også på grunn av manglende evne til NADH-gjenvinning. Siden den innfødte E. coli fermenteringsgener (adhE, frdBC og ldhA) har blitt slått ut I stamme KS8, n-butyraldehydproduksjon blir den eneste fermentative veien tilgjengelig for å resirkulere NADH tilbake TIL NAD+. Når n-butyraldehydbiosyntese er redusert, er mindre NAD + tilgjengelig for bruk i glykolyse. Som et resultat avtar glukoseforbruket. Derfor undersøkte vi neste effekten av in situ fjerning på n-butyraldehydproduksjonstiter.

Forbedring av n-butyraldehydtiter ved in situ produktfjerning

her valgte vi å bruke in situ flytende-flytende ekstraksjon for fjerning av n-butyraldehyd ved hjelp av organisk overlegg. Dodekan og oleylalkohol ble valgt som ekstraktanter på grunn av deres generelle anvendelse og ikke-toksisitet for mikrobielle kulturer . Vi bestemte partisjonskoeffisienten for n-butyraldehyd i vann og de to organiske løsningsmidlene ved å måle forholdet mellom n-butyraldehyd som forekommer i både vandig og organisk fase (Tilleggsfil 1: Figur S2) etter kraftig blanding etterfulgt av stasjonær inkubasjon ved 37 °C. den bestemte partisjonskoeffisienten for n-butyraldehyd var henholdsvis 0,141 og 0,764 for dodekan og oleylalkohol. Dette resultatet indikerte at oleylalkohol kan være et mer egnet ekstraktant for n-butyraldehyd, da høyere partisjonskoeffisient indikerer det høyere forholdet mellom n-butyraldehyd som finnes i det organiske laget. Disse to ekstraktantene er bare mildt giftige For E. coli, da veksten av n-butyraldehydproducerende stamme dyrket i nærvær av enten dodekan eller oleylalkohol bare var litt senket sammenlignet med kontrollen uten ekstraktant (Fig. 4a), som indikerer egnetheten til disse løsningsmidlene for in situ-ekstraksjon. Som resultatene vist I Fig. 4b, n-butyraldehyd titer betydelig forbedret i nærvær av ekstraktant. Konsekvent for både dodekan og oleylalkohol, ved bruk av 1 volum av ekstraktant utkonkurrerer det ved bruk av 0,5 volum. Den beste tilstanden ved bruk av oleylalkohol med et 1: 1 ekstraktant-til-kultur volumforhold produserte over 0,6 g/L n-butyraldehyd, noe som representerer en nesten tre ganger forbedring over ingen ekstraktant. Som forventet overgikk oleylalkohol dodekan som ekstraktant for n-butyraldehyd (Fig. 4c), i samsvar med partisjonskoeffisientene.

Effekt av å redusere mediekompleksiteten på n-butyraldehydproduksjon

Deretter evaluerte vi effekten av gjærekstrakt og tryptonkonsentrasjon på n-butyraldehydproduksjon. Å bruke terrific broth (TB) er vanligvis ikke kommersielt levedyktig på grunn av sin dyre kostnad. Videre er aldehyder reaktive og kan spontant danne Schiff base med aminer. SIDEN TB inneholder store mengder gjærekstrakt og trypton, kan aldehyder sannsynligvis spontant reageres med aminogruppene som er tilstede på aminosyrer og oligopeptider i TB. Ved Å bruke m9 media med glukose som base, supplerer vi 0 til 2% gjærekstrakt eller trypton for å bestemme et optimalt nivå. Resultatene er oppsummert I Fig. 5. Figur 5a viser effekten av gjærekstrakt konsentrasjon på produksjon av n-butyraldehyd etter 24 h av anaerob inkubasjon. n-Butyraldehyd titer var ikke signifikant følsom for gjærekstrakt konsentrasjon mellom 0,125 og 2%. Men hvis ingen gjærekstrakt ble tilsatt, ble det bare observert minimal mengde n-butyraldehyd, noe som indikerer betydningen av kompleks nitrogenkilde. Interessant nok hadde De som brukte m9 med gjærekstrakt et høyere aldehyd-til-alkoholforhold enn DET som brukte TB på grunn av høyere nivåer av butanol produsert. 48-h post-anaerob bryter (Fig. 5b) viste liten reduksjon i n-butyraldehyd og økning i n-butanol titer, noe som indikerer funksjonell alkoholdehydrogenase aktivt omdanner n-butyraldehyd til n-butanol.

n-Butyraldehydproduksjon var mer følsom for tryptonkonsentrasjon enn gjærekstrakt som kulturer som inneholdt 0,125 og 0.25% trypton viste lavere n-butyraldehydtiter sammenlignet med tilsvarende konsentrasjoner av gjærekstrakt (Fig. 5c, d). Økende tryptonkonsentrasjon førte til økt n-butanolproduksjon, noe som indikerer at trypton bidro til senket aldehyd-til-alkoholforhold for BRUK AV TB som produksjonsmedier. Ved å sammenligne komponentene av gjærekstrakt og trypton fra produsentens håndbok, la vi merke til at trypton har høyere prosentandel av større molekyler med molekylvekt i området enn 500-2000 Da, noe som indikerer en større mengde oligopeptider. På den annen side inneholder gjærekstrakt for det meste mindre molekyler med molekylvekt mindre enn 250 Da. Det er mulig at dette avviket førte til forskjellige uttrykksmønstre som kan omfatte ikke-spesifikke innfødte alkoholdehydrogenaser som kan redusere n-butyraldehyd. Likevel er den nøyaktige mekanismen for hvorfor trypton forårsaker økning i n-butanolproduksjon uklart.