hernieuwbare synthese van n-butyraldehyde uit glucose door geconstrueerde Escherichia coli

selectie van CoA-acylerende aldehydedehydrogenase voor n-butyraldehydeproductie

n-Butyraldehyde is een intermediair in de Clostridium COA-afhankelijke n-butanol productieweg (Fig. 1 ter). Bifunctionele aldehyde / alcoholdehydrogenase AdhE2 katalyseert echter de directe omzetting in twee stappen van butyryl-CoA in n-butanol, waarbij n-butyraldehyde als product wordt omzeild. Om de omzetting van n-butyraldehyde in n-butanol te voorkomen, vervingen we eerst AdhE2 door CoA-acylerende aldehydedehydrogenase (Aldh), waardoor alleen de omzetting van butyryl-CoA in n-butyraldehyde gekatalyseerd werd. Sommige Clostridia zoals Clostridium beijerinckii bevatten individuele Aldh en Adh in plaats van een bifunctioneel enzym voor butanolproductie. Als alternatief wordt Aldh gevonden in de afbraakroutes voor ethanolamine en 1,3-propaandiol . De Aldh uit ethanolamine – en 1,3-propaandiolgebruiksoperons zijn echter niet specifiek voor butyryl-CoA-reductie en er is eerder aangetoond dat ze ethanol produceren wanneer ze worden uitgedrukt in E. coli . Daarom kozen we voor de huidige studie om te werken met Clostridium Aldh. Op basis van de sequentie van aldh uit C. beijerinckii hebben we twee extra homologen uit C. saccharoticum en C. saccharooperbutylacetonicum geselecteerd , evenals een mutant aldh uit C. beijerinckii die we eerder in ons lab hebben geïsoleerd (zie aanvullend dossier 1 voor de sequentie). Deze vier aldh genen werden individueel gekloond tot synthetische operonen met de genen die nodig zijn om acetyl-CoA om te zetten in butyryl-CoA (Fig. 1 ter). Deze synthetische operonen werden aangedreven door native E. coli promotor van respectievelijk ack en adhE genen, Pack en PadhE, die eerder hogere titers butanol hebben geproduceerd in vergelijking met het gebruik van Iptg-induceerbare pllaco1 promotor . Hier werden de verpakking en PadhE gedefinieerd om de ribosomale bindingsplaats en 5′ onvertaald gebied stroomopwaarts van hun overeenkomstige genen te omvatten. atoB, aldh, crt en hbd werden gekloond als één operon op een plasmide van colE1 oorsprong onder controle van Pack. ter en fdh werden individueel uitgedrukt op plasmiden van colA en psc101-oorsprong, respectievelijk, onder controle van PadhE . Deze plasmiden werden omgezet in E. coli stam JCL299 die eerder werd getoond om efficiënt n-butanol te produceren en ldha, adhE, frdBC, en PTA knock-out heeft . Nadat de gemengde zure fermentatiewegen zijn uitgeschakeld, kan jcl299 acetyl-CoA en NADH efficiënt kanalen voor de synthese van n-butyraldehyde. Zoals verwacht vertoonden de resulterende stammen, door de aanwezigheid van endogene alcoholdehydrogenasen, een minimale productie van n-butyraldehyde (Fig. 2 bis). Het merendeel van de fermentatieproducten was n-butanol in de stammen die de vier verschillende aldh-genen uitdrukten. Chromosomale yqhd, coderend voor NADPH-afhankelijke alcoholdehydrogenase, is gekend om aldehyden tot hun overeenkomstige alcoholen te verminderen en hoogst actief als ontgiftingsmechanisme . Daarom hebben we yqhD uitgeschakeld in JCL299, wat stam ELeco1 opleverde. Als expressie van de n-butyraldehydeweg in stam ELeco1 werd n-butyraldehydeproductie waargenomen. De beste stam ELeco1/pKU48/pRW18 / pRW22 produceerde 0,16 g / L N-butyraldehyde (Fig. 2b). De aldehyde-alcoholverhouding was echter 0,39. Deze lage aldehyde-alcoholverhouding wijst op de aanwezigheid van andere actieve inheemse Adh die n-butyraldehyde kan verminderen.

verbetering van de aldehyde-alcoholverhouding door native alcoholdehydrogenases

uit te schakelen om de n-butanolvorming te verminderen en de aldehyde-alcoholverhouding te verhogen, schakelden we de genen uit die coderen voor andere native Adh. Op basis van eerder werk voor de productie van isobutyraldehyde hebben we acht adh-genen verwijderd die waarschijnlijk zullen bijdragen aan de reductie van n-butyraldehyde: yjgB , fucO, eutG, ybbO, adhP, gldA, yahK en yghA. Deze genen werden geselecteerd omdat hun knockouts tot hogere productietiters van isobutyraldehyde leidden. We hebben elk van deze adh-genen achtereenvolgens uitgeschakeld met behulp van P1-faagtransductie met de Keio-collectie. Aangezien elk van deze ADH genen om efficiënt voor het verhogen van isobutyraldehydeproductie zijn getoond, werden zij zonder specifieke orde uitgeslagen. De resultaten van n-butyraldehyde productie titers en de aldehyde-alcohol Verhouding van deze mutant stammen zijn weergegeven in Fig. 3. We merkten op dat de titers van de ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22 vergelijkbaar zijn met die van de gepubliceerde octrooiaanvraag van Easel Biotechnologies , waarbij een stam met identiek genotype werd gebruikt. Echter, omdat de n-butanoltiters niet werden gerapporteerd in hun werk, kunnen de butyraldehyde-tot-butanolverhoudingen niet worden vergeleken. Niettemin, hier namen we het stamontwerp verder en toonden aan dat extra knockouts van inheemse ADH genen tot significante vermindering van butanol leidden. De uiteindelijke stam KS8/pKU48/pRW18/pRW22 bereikte een aldehyde/alcoholverhouding van 3,1, wat een achtvoudige verbetering betekent in vergelijking met stam ELeco1/pKU48 / pRW18 / pRW22. Hier merkten we op dat Stam KS7 met dezelfde plasmiden een iets hogere aldehyde / alcohol Verhouding van 3,4 bereikte. Het verschil in aldehyde-alcoholverhoudingen was echter binnen het foutenbereik en onbeduidend. Daarom werd stam KS8 gebruikt voor downstream experimenten. Onder de acht extra adh die we knock-out, eutG, ybbO, en yghA toonden geen effect voor het verhogen van aldehyde-alcohol verhouding. Alle andere ADH-knock-out droeg positief bij tot het verhogen van de aldehyde-alcoholverhouding, wat wijst op hun inheemse expressie en het vermogen van overeenkomstige enzymen om n-butyraldehyde te verminderen. Terwijl de aldehyde-alcoholverhouding met elk ADH gen knock-out toenam, nam de titer van n-butyraldehyde niet significant toe. Dienovereenkomstig nam de glucoseconsumptie door stammen met elke extra ADH gen knock-out ook af (Fig. 3). Deze resultaten wijzen erop dat de koolstofflux is verminderd. Analyse van de thermodynamica van elke stap toonde aan dat de reductie van butyryl-CoA tot n-butyraldehyde thermodynamisch ongunstig is met ΔG’° van 7,7 kJ/mol (berekend met behulp van eQuilibrator ), wat kan leiden tot inefficiënte omzetting van butyryl-CoA in n-butyraldehyde, vooral nadat de concentratie n-butyraldehyde een bepaalde drempel had bereikt. Het is waarschijnlijk dat aangezien de productie van n-butyraldehyde wordt vertraagd, het glucosemetabolisme ook wegens onvermogen voor NADH recycling vertraagt. Sinds de inheemse E. coli fermentatiegenen (adhE, frdBC, en ldhA) zijn knock-out in stam KS8, n-butyraldehyde productie wordt de enige fermentatieve weg beschikbaar om NADH terug te recyclen naar NAD+. Wanneer de biosynthese van n-butyraldehyde wordt vertraagd, is minder NAD+ beschikbaar voor gebruik in glycolyse. Als gevolg hiervan neemt het glucoseverbruik af. Daarom onderzochten we vervolgens het effect van in situ verwijdering op n-butyraldehyde productie titer.

verbetering van n-butyraldehydtiter door in situ productverwijdering

hier hebben we ervoor gekozen om in situ vloeistof–vloeistof extractie te gebruiken voor n-butyraldehydeverwijdering met behulp van organische overlay. Dodecaan en oleylalcohol werden geselecteerd als extractanten vanwege hun algemene toepassing en niet-toxiciteit voor microbiële culturen . We bepaalden de verdelingscoëfficiënt van n-butyraldehyde in water en de twee organische oplosmiddelen door het meten van de verhouding van n-butyraldehyde verschijnen in zowel waterige als organische fase (aanvullend dossier 1: Figuur S2) na krachtige menging gevolgd door stationaire incubatie bij 37 °C. De vastgestelde verdelingscoëfficiënt voor n-butyraldehyde was 0,141 en 0,764 voor dodecaan en oleylalcohol, respectievelijk. Dit resultaat wees erop dat oleylalcohol een geschikter extractant voor n-butyraldehyde kan zijn aangezien de hogere verdelingscoëfficiënt de hogere verhouding van n-butyraldehyde in de organische laag aangeeft. Deze twee extractanten zijn slechts licht giftig voor E. coli omdat de groei van de n-butyraldehyde producerende stam die in aanwezigheid van dodecaan of oleylalcohol wordt gekweekt, slechts lichtjes werd verminderd in vergelijking met de controle zonder extractant (Fig. 4a), met vermelding van de geschiktheid van deze oplosmiddelen voor extractie in situ. Zoals in Fig. 4b, n-butyraldehyde titer aanzienlijk verbeterd in aanwezigheid van extractiemiddel. Consequent voor zowel dodecaan als oleylalcohol presteert het gebruik van 1 volume extractant beter dan het gebruik van 0,5 volume. De beste conditie met behulp van oleylalcohol met een 1: 1 extractant-cultuur volume verhouding produceerde meer dan 0,6 g/L van n-butyraldehyde, wat een bijna drievoudige verbetering ten opzichte van geen extractant vertegenwoordigt. Zoals verwacht presteerde oleylalcohol beter dan dodecaan als extractiemiddel voor n-butyraldehyde (Fig. 4c), consistent met de verdelingscoëfficiënten.

Effect van het verminderen van de complexiteit van media op de n-butyraldehydeproductie

vervolgens hebben we het effect van gistextract en tryptonconcentratie op de n-butyraldehydeproductie geëvalueerd. Met behulp van terrific bouillon (TB) is meestal niet commercieel levensvatbaar als gevolg van de dure kosten. Verder zijn Aldehyden reactief en kunnen ze spontaan Schiff-base vormen met amines. Aangezien TB grote hoeveelheden gistextract en trypton bevat, kunnen aldehyden waarschijnlijk spontaan reageren met de aminogroepen die aanwezig zijn op aminozuren en oligopeptiden in TB. Met behulp van M9 media met glucose als basis, vullen we 0 tot 2% gistextract of tryptone aan om een optimaal niveau te bepalen. De resultaten zijn samengevat in Fig. 5. Figuur 5a toont het effect van gistextractconcentratie op de productie van n-butyraldehyde na 24 uur anaërobe incubatie. n-Butyraldehydtiter was niet significant gevoelig voor gistextractconcentraties tussen 0,125 en 2%. Als er echter geen gistextract werd toegevoegd, werd slechts een minimale hoeveelheid n-butyraldehyde waargenomen, wat het belang van complexe stikstofbron aangeeft. Interessant, die die M9 met gistextract gebruiken hadden een hogere aldehyde-aan-alcoholverhouding dan die gebruikend TB toe te schrijven aan hogere niveaus van geproduceerde butanol. 48-h post-anaërobe schakelaar (vijg. 5b) toonde een lichte afname van n-butyraldehyde en een toename van n-butanol titer, wat wijst op functionele alcoholdehydrogenase die actief n-butyraldehyde omzet in n-butanol.

de productie van n-Butyraldehyden was gevoeliger voor de tryptonconcentratie dan die van gistextract, omdat deze culturen 0,125 en 0 bevatten.25% trypton vertoonde een lagere n-butyraldehyde titer in vergelijking met de overeenkomstige concentraties van gistextract (Fig. 5c, d). De stijgende tryptonconcentratie leidde tot een verhoogde n-butanolproductie, wat erop wijst dat trypton bijdroeg aan de verlaagde aldehyde-alcoholverhouding voor het gebruik van TB als productiemedium. Door de componenten van gistextract en tryptone uit de MANUAl van de fabrikant te vergelijken, merkten we dat tryptone een hoger percentage grotere moleculen heeft met een molecuulgewicht van meer dan 500-2000 Da, wat wijst op een grotere hoeveelheid oligopeptiden. Anderzijds bevat gistextract meestal kleinere moleculen met een molecuulgewicht van minder dan 250 Da. Het is mogelijk dat deze discrepantie leidde tot verschillende expressiepatronen die niet-specifieke inheemse alcoholdehydrogenasen kunnen omvatten die n-butyraldehyde kunnen verminderen. Niettemin is het exacte mechanisme waarom tryptone toename van de n-butanol productie veroorzaakt onduidelijk.