odnawialna synteza N-butyraldehydu z glukozy metodą inżynierii Escherichia coli

wybór dehydrogenazy aldehydowej Coa-acylującej do produkcji N-butyraldehydu

N-Butyraldehyd jest produktem pośrednim w szlaku produkcji N-butanolu zależnym od Clostridium Coa (Fig. 1B). Jednak dwufunkcyjna dehydrogenaza aldehydowo-alkoholowa AdhE2 katalizuje bezpośrednią dwuetapową konwersję butyrylo-CoA do n-butanolu, omijając aldehyd N-butyrowy jako produkt. Aby uniknąć konwersji N-butyraldehydu do n-butanolu, najpierw zastąpiliśmy AdhE2 Dehydrogenazą aldehydową Coa-acylującą (Aldh), katalizując tylko konwersję butyrylo-CoA do n-butyraldehydu. Niektóre Clostridia, takie jak Clostridium beijerinckii zawierają pojedyncze Aldh i Adh zamiast dwufunkcyjnego enzymu do produkcji butanolu. Alternatywnie, Aldh znajduje się w szlakach degradacji etanoloaminy i 1,3-propanodiolu . Jednakże Aldh z etanoloaminy i operonów wykorzystujących 1,3-propanodiol nie są specyficzne dla redukcji butyrylo-CoA i wcześniej wykazano, że wytwarzają Etanol w ekspresji w E. coli . Dlatego do niniejszego badania zdecydowaliśmy się na pracę z Clostridium Aldh. Opierając się na sekwencji aldh z C. beijerinckii, wybraliśmy dwa dodatkowe homologi z C. saccharolyticum i C. saccharoloperbutyloacetonicum, a także zmutowany aldh z C. beijerinckii, który wyizolowaliśmy wcześniej w naszym laboratorium (patrz dodatkowy plik 1 dla jego sekwencji). Te cztery geny aldh klonowano indywidualnie do syntetycznych operonów z genami niezbędnymi do przekształcenia acetylo-CoA w butyrylo-Coa (Fig. 1B). Te syntetyczne operony były napędzane przez natywny promotor E. coli genów ACK i adhE, odpowiednio Pack i PadhE, które wcześniej wykazały, że wytwarzają wyższe miana butanolu w porównaniu z promotorem pllaco1 indukowanym przez IPTG . Tutaj Pack i PadhE zostały zdefiniowane tak, aby obejmowały miejsce wiązania rybosomalnego i 5 ’ nieprzetłumaczony region przed odpowiadającymi im genami. atoB, aldh, crt i hbd klonowano jako jeden operon na plazmidzie pochodzenia colE1 pod kontrolą Pack. ter i fdh wyrażano indywidualnie na plazmidach pochodzenia colA i psc101, odpowiednio, pod kontrolą PadhE . Plazmidy te przekształcono w szczep E. coli jcl299, który wcześniej wykazano, że skutecznie wytwarza n-butanol i ma znokautowane ldhA, adhE, frdBC i pta . Po wyeliminowaniu mieszanych ścieżek fermentacji kwasowej JCL299 skutecznie kieruje acetylo-CoA i NADH do syntezy N-butyraldehydu. Zgodnie z oczekiwaniami, ze względu na obecność endogennych dehydrogenaz alkoholowych, uzyskane szczepy wykazały minimalną produkcję aldehydu N-masłowego (Fig. 2A). Większość produktów fermentacji stanowiła n-butanol w szczepach wykazujących ekspresję czterech różnych genów aldh. Chromosom yqhd, kodujący dehydrogenazę alkoholową zależną od NADPH, jest znany z redukcji aldehydów do odpowiadających im alkoholi i wysoce aktywny jako mechanizm detoksykacji . Dlatego znokautowaliśmy yqhD w JCL299, dając szczep ELeco1. Obserwowano ekspresję szlaku N-butyraldehydu w szczepie ELeco1, wytwarzanie N-butyraldehydu. Najlepszy szczep ELeco1 / pKU48 / pRW18 / pRW22 wytwarzał 0,16 g / L aldehydu N-masłowego (rys. 2b). Jednak stosunek aldehydu do alkoholu wynosił 0,39. Ten niski stosunek aldehydu do alkoholu wskazuje na obecność innego aktywnego natywnego Adh zdolnego do redukcji aldehydu N-masłowego.

poprawiając stosunek aldehydu do alkoholu przez wyeliminowanie natywnych dehydrogenaz alkoholowych

, aby zmniejszyć tworzenie N-butanolu i zwiększyć stosunek aldehydu do alkoholu, wyeliminowaliśmy geny kodujące inny natywny Adh. W oparciu o wcześniejsze prace nad produkcją aldehydu izomasłowego usunęliśmy osiem genów adh, które mogą przyczyniać się do redukcji aldehydu N-masłowego: yjgB, fucO, eutG, ybbO, adhP, gldA, yahK i yghA. Geny te zostały wybrane, ponieważ ich nokauty doprowadziły do wyższych mian produkcji aldehydu izomasłowego. Sekwencyjnie znokautowaliśmy każdy z tych genów adh za pomocą transdukcji fagowej P1 z kolekcją Keio. Ponieważ wszystkie te geny adh okazały się skuteczne w zwiększaniu produkcji aldehydu izomasłowego, zostały wyeliminowane bez określonej kolejności. Wyniki mian produkcji N-aldehydu maślanego i stosunek aldehydu do alkoholu tych zmutowanych szczepów przedstawiono na Fig. 3. Zauważyliśmy , że miana uzyskane przez eleco1/pKU48/pRW18/pRW22 są porównywalne z tymi uzyskanymi przez opublikowane zgłoszenie patentowe z Easel Biotechnologies, w którym zastosowano szczep o identycznym genotypie. Ponieważ jednak miana N-butanolu nie zostały zgłoszone w ich pracy, nie można porównać stosunku aldehydu maślanego do butanolu. Niemniej jednak, tutaj wzięliśmy projekt szczepu dalej i pokazał, że dodatkowe nokauty natywnych genów adh doprowadziły do znaczącej redukcji butanolu. Końcowy szczep KS8/pKU48/pRW18/pRW22 osiągnął stosunek aldehydu do alkoholu 3,1, co stanowi ośmiokrotną poprawę w porównaniu do szczepu ELeco1/pKU48/pRW18 / pRW22. Tutaj zauważyliśmy, że szczep KS7 zawierający te same plazmidy osiągnął nieco wyższy stosunek aldehydu do alkoholu wynoszący 3,4. Jednak różnica w stosunku aldehydu do alkoholu mieściła się w zakresie błędu i była nieznaczna. Dlatego szczep KS8 był używany do dalszych eksperymentów. Wśród ośmiu dodatkowych adh, które znokautowaliśmy, eutG, ybbO i yghA nie wykazały wpływu na zwiększenie stosunku aldehydu do alkoholu. Wszystkie inne ADH knock out przyczyniły się pozytywnie do zwiększenia stosunku aldehydu do alkoholu, wskazując na ich natywną ekspresję i zdolność odpowiednich enzymów do redukcji N-butyraldehydu. Podczas gdy stosunek aldehydu do alkoholu wzrastał z każdym wybiciem genu adh, miana aldehydu N-masłowego nie wzrastały znacząco. Odpowiednio zmniejszyło się również zużycie glukozy przez szczepy z każdym dodatkowym genem ADH knock out (Fig. 3). Wyniki te wskazują, że strumień węgla został zmniejszony. Analiza termodynamiki każdego etapu wykazała, że redukcja butyrylo-CoA do n-aldehydu butyrylowego jest termodynamicznie niekorzystna z ΔG’° wynoszącym 7,7 kJ/mol (obliczona przy użyciu równoważnika), co może prowadzić do nieefektywnej konwersji butyrylo-CoA do n-aldehydu butyrylowego, szczególnie po osiągnięciu pewnego progu stężenia N-aldehydu butyrylowego. Jest prawdopodobne, że ponieważ produkcja N-aldehydu maślanego jest spowolniona, metabolizm glukozy również spowalnia z powodu niezdolności do recyklingu NADH. Od rodzimego E. geny fermentacji coli (adhE, frdBC i ldhA) zostały znokautowane w szczepie KS8, produkcja N-butyraldehydu staje się jedyną dostępną ścieżką fermentacyjną do recyklingu NADH z powrotem do NAD+. Gdy biosynteza N-aldehydu jest spowolniona, mniej NAD+ jest dostępne do stosowania w glikolizie. W rezultacie zmniejsza się tempo spożycia glukozy. Dlatego następnie zbadaliśmy wpływ usuwania in situ na miano produkcji N-aldehydu masłowego.

Poprawa miana N-butyraldehydu przez Usuwanie produktu in situ

tutaj zdecydowaliśmy się użyć ekstrakcji in situ ciecz–ciecz do usuwania N-butyraldehydu za pomocą nakładki organicznej. Dodekan i alkohol oleilowy wybrano jako substancje ekstrahujące ze względu na ich ogólne zastosowanie i nietoksyczność dla kultur drobnoustrojów . Współczynnik podziału aldehydu N-masłowego w wodzie i dwóch rozpuszczalnikach organicznych oznaczono mierząc stosunek N-masłowego aldehydu występującego zarówno w fazie wodnej, jak i organicznej (dodatkowy plik 1: Rysunek S2) po energicznym wymieszaniu, a następnie inkubacji stacjonarnej w temperaturze 37 °C. ustalony Współczynnik podziału dla N-masłowego aldehydu wynosił odpowiednio 0,141 i 0,764 dla dodekanu i alkoholu oleinowego. Wynik ten wskazywał, że alkohol oleinowy może być bardziej odpowiednim ekstraktantem dla N-butyraldehydu, ponieważ wyższy współczynnik podziału wskazuje na wyższy stosunek N-butyraldehydu występującego w warstwie organicznej. Te dwa ekstraktanty są tylko nieznacznie toksyczne dla E. coli, ponieważ wzrost szczepu produkującego N-aldehyd maślany uprawianego w obecności dodekanu lub alkoholu oleinowego był tylko nieznacznie obniżony w porównaniu z grupą kontrolną bez ekstrakcji (Fig . 4a), wskazując przydatność tych rozpuszczalników do ekstrakcji in situ. Jak pokazano na Fig. 4B, miano N-aldehydu maślanego znacznie poprawiło się w obecności ekstraktanta. Konsekwentnie zarówno dla dodekanu, jak i alkoholu oleilowego, użycie 1 objętości ekstrahantu przewyższa to użycie 0,5 objętości. Najlepszy stan przy użyciu alkoholu oleinowego o stosunku objętościowym 1: 1 ekstrahującego do kultury wytworzył ponad 0,6 g/L aldehydu N-masłowego, co stanowiło prawie trzykrotną poprawę w stosunku do braku ekstrahującego. Zgodnie z oczekiwaniami, alkohol oleinowy przewyższał Dodekan jako ekstrahent dla aldehydu N-masłowego (Fig. 4c), zgodne ze współczynnikami podziału.

wpływ zmniejszenia złożoności mediów na produkcję N-aldehydu masłowego

następnie oceniliśmy wpływ ekstraktu drożdżowego i stężenia tryptonu na produkcję N-aldehydu masłowego. Za pomocą terrific bulion (TB) jest zazwyczaj nie opłacalne komercyjnie ze względu na jego kosztowne. Ponadto aldehydy są reaktywne i mogą samoistnie tworzyć zasadę Schiffa z aminami. Ponieważ TB zawiera duże ilości ekstraktu drożdżowego i tryptonu, aldehydy mogą być spontanicznie reagowane z grupami aminowymi obecnymi na aminokwasach i oligopeptydach w TB. Stosując podłoże M9 z glukozą jako bazą, uzupełniamy od 0 do 2% ekstraktu drożdżowego lub tryptonu, aby określić optymalny poziom. Wyniki podsumowano na Fig. 5. 5A przedstawia wpływ stężenia ekstraktu drożdżowego na wytwarzanie aldehydu N-masłowego po 24 h inkubacji beztlenowej. miano N-aldehydu masłowego nie było znacząco wrażliwe na stężenie ekstraktu drożdżowego w zakresie od 0,125 do 2%. Jeśli jednak nie dodano ekstraktu drożdżowego, zaobserwowano tylko minimalną ilość N-butyraldehydu, co wskazuje na znaczenie złożonego źródła azotu. Co ciekawe, osoby stosujące M9 z ekstraktem drożdżowym miały wyższy stosunek aldehydu do alkoholu niż TB z powodu wyższych poziomów wytwarzanego butanolu. 48-godzinny przełącznik beztlenowy (rys. 5B) wykazywał nieznaczne zmniejszenie stężenia N-butyraldehydu i zwiększenie miana N-butanolu, co wskazuje na czynnościową dehydrogenazę alkoholową aktywnie przekształcającą N-butyraldehyd w n-butanol.

wytwarzanie N-aldehydu maślanego było bardziej wrażliwe na stężenie tryptonu niż ekstrakt drożdżowy w kulturach zawierających 0,125 i 0.25% tryptonu wykazywało niższe miano N-aldehydu masłowego w porównaniu z odpowiednimi stężeniami ekstraktu drożdżowego (Fig. 5c, d). Zwiększenie stężenia tryptonu doprowadziło do zwiększenia produkcji N-butanolu, co wskazuje, że trypton przyczynił się do obniżenia stosunku aldehydu do alkoholu w przypadku stosowania TB jako nośnika produkcyjnego. Porównując składniki ekstraktu drożdżowego i tryptonu z instrukcji producenta, zauważyliśmy, że trypton ma większy procent większych cząsteczek o masie cząsteczkowej w zakresie niż 500-2000 Da, co wskazuje na większą ilość oligopeptydów. Z drugiej strony ekstrakt drożdżowy zawiera głównie mniejsze cząsteczki o masie cząsteczkowej mniejszej niż 250 Da. Jest możliwe, że ta rozbieżność doprowadziła do różnych wzorców ekspresji, które mogą obejmować niespecyficzne natywne dehydrogenazy alkoholowe zdolne do redukcji N-butyraldehydu. Niemniej jednak dokładny mechanizm powodujący wzrost produkcji N-butanolu przez trypton jest niejasny.