Renováveis síntese de n-butyraldehyde a partir da glicose pela engenharia de Escherichia coli

Selecção de CoA-acylating aldeído desidrogenase para n-butyraldehyde produção

n-Butyraldehyde é um intermediário na Clostridium CoA-dependente n-butanol produção caminho (Fig. 1b). No entanto, aldeído bifuncional / álcool desidrogenase AdhE2 catalisa a conversão direta de duas etapas de butiril-CoA Para n-butanol, contornando n-butiraldeído como um produto. Para evitar a conversão de N-butiraldeído em n-butanol, substituímos pela primeira vez AdhE2 por aldeído desidrogenase Coa-acilante (Aldh), catalisando apenas a conversão de butiril-CoA em n-butiraldeído. Alguns clostrídios como Clostridium beijerinckii contêm Aldh e Adh individuais em vez de uma enzima bifuncional para a produção de butanol. Em alternativa, o Aldh encontra-se nas vias de degradação da etanolamina e do 1,3-propanodiol . Contudo, o Aldh dos operões de Utilização da etanolamina e do 1,3-propanodiol não é específico para a redução do butiril-CoA e demonstrou anteriormente produzir etanol quando expresso em E. coli . Portanto, para o presente estudo, optamos por trabalhar com Clostridium Aldh. Com base na sequência de aldh de C. beijerinckii , escolhemos dois homólogos adicionais da C. saccharolyticum e C. saccharoperbutylacetonicum, bem como um mutante aldh de C. beijerinckii que nós isolado anteriormente em nosso laboratório (ver arquivo Adicionais 1 para a sua sequência). Estes quatro genes aldh foram clonados individualmente em operões sintéticos com os genes necessários para converter acetil-CoA em butiril-CoA(Fig. 1b). Estes operões sintéticos foram conduzidos pelo promotor nativo de E. coli dos genes ack e adhE, Pack e PadhE, respectivamente, que demonstraram anteriormente produzir títulos mais elevados de butanol em comparação com o promotor de PLlacO1 induzido pela IPTG . Neste caso, a embalagem e o PadhE foram definidos de modo a incluir o local de ligação ribossómica e a região não traduzida 5′ a montante dos seus genes correspondentes. atoB, aldh, crt e hbd foram clonados como um operão em um plasmídeo de origem colE1 sob o Controle Da Embalagem. as ter e fdh foram expressas individualmente em plasmídeos de origem colA e pSC101, respectivamente, sob o controlo de PadhE . Estes plasmídeos foram transformados em E. coli estirpe JCL299, que foi anteriormente demonstrado produzir eficientemente n-butanol e tem ldhA, adhE, frdBC e pta nocauteados . Tendo as vias de fermentação ácida mista eliminadas, o JCL299 canaliza eficazmente acetil-CoA e NADH para a síntese do n-butiraldeído. Como esperado, devido à presença de desidrogenases endógenas de álcool, as estirpes resultantes mostraram uma produção mínima de N-butiraldeído (Fig. 2a). A maioria dos produtos de fermentação era n-butanol através das estirpes que expressavam os quatro genes aldh diferentes. O yqhD cromossómico, que codifica para a desidrogenase alcoólica dependente do NADPH, é conhecido por reduzir os aldeídos aos seus álcoois correspondentes e altamente activo como mecanismo de desintoxicação . Portanto, eliminámos o yqhD em JCL299, produzindo a estirpe Electo1. Expressando a via de N-butiraldeído na estirpe Electo1, foi observada produção de N-butiraldeído. A melhor estirpe Electo1 / pKU48 / pRW18 / pRW22 produziu 0,16 g/L de N-butiraldeído (Fig. 2b). No entanto, a razão aldeído-álcool foi de 0,39. Esta baixa razão aldeído-álcool indica a presença de outro ADH nativo ativo capaz de reduzir o n-butiraldeído.

Melhorar a aldeído-a-álcool relação ao nocautear nativo álcool dehydrogenases

Para diminuir o n-butanol formação e aumentar a aldeído-a-álcool razão, temos eliminado a genes que codificam para outro nativo Adh. Com base em trabalhos anteriores para a produção de isobutiraldeído, eliminamos oito genes adh que são susceptíveis de contribuir para a redução do n-butiraldeído: yjgB, fucO, eutG, ybbO, adhP, gldA, yahK e yghA. Estes genes foram selecionados porque seus knockouts levaram a títulos de produção mais elevados de isobutiraldeído. Nós eliminamos sequencialmente cada um desses genes adh usando transdução de FAG P1 com a coleção Keio. Uma vez que todos estes genes adh têm demonstrado ser eficazes para aumentar a produção de isobutiraldeído, eles foram eliminados sem ordem específica. Os resultados dos títulos de produção de N-butiraldeído e da razão aldeído-álcool destas estirpes mutantes são apresentados na Fig. 3. Constatámos que os títulos obtidos pelo Electo1/pKU48/pRW18/pRW22 são comparáveis aos obtidos pelo pedido de patente publicado da Easel Biotechnologies , que utilizou uma estirpe com genótipo idêntico. No entanto, uma vez que os títulos de n-butanol não foram referidos no seu trabalho, as razões butiraldeído-butanol não podem ser comparadas. No entanto, aqui levámos o desenho da estirpe mais longe e mostrámos que os knockouts adicionais de genes nativos de adh levaram a uma redução significativa no butanol. A estirpe final KS8/pKU48/pRW18/pRW22 atingiu uma razão aldeído-álcool de 3.1, representando uma melhoria oito vezes superior à estirpe Electo1/pKU48/pRW18 / pRW22. Aqui observamos que a estirpe KS7 que abrigava os mesmos plasmídeos atingiu uma relação entre aldeído e álcool ligeiramente mais elevada de 3,4. No entanto, a diferença entre os rácios aldeído-álcool estava dentro do intervalo de erro e era insignificante. Por conseguinte, a estirpe KS8 foi utilizada em experiências a jusante. Entre os oito adh adicionais que derrubamos, eutG, ybbO e yghA não mostraram nenhum efeito para aumentar a razão aldeído-álcool. Todos os outros ADH knock out contribuíram positivamente para o aumento da razão aldeído-álcool, indicando a sua expressão nativa e a capacidade das enzimas correspondentes de reduzir o n-butiraldeído. Enquanto a razão aldeído-álcool aumentou com cada gene adh knock out, o título de N-butiraldeído não aumentou significativamente. Consequentemente, o consumo de glucose por estirpes com cada gene adh adicional eliminado também diminuiu (Fig. 3). Estes resultados indicam que o fluxo de carbono foi reduzido. Análise termodinâmica de cada etapa revelou que butyryl-CoA a redução de n-butyraldehyde é termodinamicamente desfavorável com ΔG’° de 7,7 kJ/mol (calculadas usando o eQuilibrator ), o que pode levar à ineficiência de conversão de butyryl-CoA para n-butyraldehyde, particularmente depois de n-butyraldehyde concentração atingiu um determinado limiar. É provável que, à medida que a produção de N-butiraldeído é retardada, o metabolismo da glucose também diminui devido à incapacidade de reciclagem de NADH. Desde o nativo E. genes de fermentação de coli (adhE, frdBC e ldhA) foram eliminados na estirpe KS8, a produção de N-butiraldeído torna-se a única via fermentativa disponível para reciclar NADH de volta para NAD+. Quando a biossíntese do n-butiraldeído é retardada, menos NAD+ está disponível para uso na glicólise. Como resultado, a taxa de consumo de glicose diminui. Por conseguinte, investigámos em seguida o efeito da remoção in situ sobre o título de produção de N-butiraldeído.

melhoria do título de N-butiraldeído por remoção in situ do produto

aqui optámos por utilizar in situ extracção líquido–líquido para remoção de N-butiraldeído utilizando revestimento orgânico. O dodecano e o álcool oleílico foram selecionados como extrativos devido à sua aplicação geral e à sua não toxicidade para culturas microbianas . Determinou-se o coeficiente de partição n-butyraldehyde na água e os dois solventes orgânicos, medindo a proporção de n-butyraldehyde que aparecem em ambos os aquosa e a fase orgânica (arquivo Adicionais 1: Figura S2) depois de uma agitação vigorosa seguido por estacionárias de incubação a 37 °C. A determinado coeficiente de partição n-butyraldehyde foi 0.141 e 0.764 para dodecane e oleyl álcool, respectivamente. Este resultado indicou que oleyl o álcool pode ser um mais adequado extrator para n-butyraldehyde como o aumento do coeficiente de partição indica a proporção mais elevada de n-butyraldehyde encontrado na camada orgânica. Estes dois extractantes são apenas ligeiramente tóxicos para E. coli, uma vez que o crescimento da estirpe produtora de N-butiraldeído cultivada na presença de dodecano ou álcool oleílico foi apenas ligeiramente reduzido em comparação com o controlo sem qualquer extractante (Fig. 4a), indicando a adequação destes solventes para extracção in situ. Como os resultados apresentados na Fig. O título de N-butiraldeído 4b melhorou significativamente na presença de extractante. Consistentemente para dodecano e álcool oleílico, usando 1 volume de extractante supera que usando 0,5 volume. A melhor condição de utilização de álcool oleílico com uma razão de volume extractante-Cultura 1: 1 produzido sobre 0,6 g/L de N-butiraldeído, representando uma melhoria quase três vezes superior a nenhum extractante. Como esperado, o álcool oleílico superou o dodecano como extractante para o n-butiraldeído (Fig. 4c), consistente com os coeficientes de partição.

Efeito de reduzir media complexidade em n-butyraldehyde produção

em seguida, avaliou-se o efeito de extrato de levedura e tryptone concentração de n-butyraldehyde de produção. O uso de caldo fantástico (TB) normalmente não é comercialmente viável devido ao seu custo caro. Além disso, os aldeídos são reativos e podem formar espontaneamente a base de Schiff com aminas. Uma vez que a TB contém elevadas quantidades de extracto de levedura e triptona, é provável que os aldeídos possam reagir espontaneamente com os grupos aminoácidos presentes nos aminoácidos e oligopeptídeos presentes na TB. Usando M9 mídia com glicose como base, adicionamos extrato de levedura de 0 a 2% ou triptona para determinar um nível ótimo. Os resultados estão resumidos na Fig. 5. A figura 5a mostra o efeito da concentração do extrato de levedura na produção de N-butiraldeído após 24 h de incubação anaeróbica. o título de N-Butiraldeído não foi significativamente sensível à concentração de extrato de levedura entre 0,125% e 2%. No entanto, se não foi adicionado nenhum extracto de levedura, apenas foi observada uma quantidade mínima de N-butiraldeído, indicando a importância da fonte complexa de azoto. Curiosamente, os que usavam M9 com extrato de levedura tinham uma razão aldeído-álcool mais elevada do que a que usava TB devido aos níveis mais elevados de butanol produzido. Interruptor pós-anaeróbico 48-h (Fig. 5b) apresentou uma ligeira diminuição no n-butiraldeído e um aumento no título de n-butanol, indicando a desidrogenase alcoólica funcional que converte activamente n-butiraldeído em n-butanol.

n-Butyraldehyde produção foi mais sensível para tryptone concentração do que o extrato de levedura como culturas contendo de 0,125 e 0.25% de triptona apresentaram um título inferior de N-butiraldeído em comparação com as concentrações correspondentes de extrato de levedura (Fig. 5c, d). O aumento da concentração de triptona levou ao aumento da produção de n-butanol, indicando que a triptona contribuiu para a redução da razão aldeído-álcool pelo uso de TB como meio de produção. Comparando os componentes de extrato de levedura e triptona do manual de fabricantes, percebemos que a triptona tem uma maior porcentagem de moléculas maiores com peso molecular na faixa de 500-2000 Da, indicando uma maior quantidade de oligopeptídeos. Por outro lado, o extrato de levedura contém principalmente moléculas menores com peso molecular inferior a 250 Da. É possível que esta discrepância tenha levado a diferentes padrões de expressão que podem incluir desidrogenases de álcool nativas não específicas capazes de reduzir o n-butiraldeído. Não obstante, não é claro o mecanismo exacto para explicar as causas do aumento da produção de n-butanol.