sinteza regenerabilă a n-butiraldehidei din glucoză prin inginerie Escherichia coli

selectarea aldehidei dehidrogenazei CoA-acilante pentru producția de n-butiraldehidă

n-Butiraldehida este un intermediar în calea de producție a n-butanolului dependent de Clostridium CoA (Fig. 1b). Cu toate acestea, aldehidă bifuncțională/alcool dehidrogenază AdhE2 catalizează conversia directă în două etape a butiril-CoA în n-butanol, ocolind n-butiraldehida ca produs. Pentru a evita conversia n-butiraldehidei în n-butanol, am înlocuit mai întâi AdhE2 cu COA-acilant aldehidă dehidrogenază (Aldh), catalizând doar conversia butiril-CoA în n-butiraldehidă. Unele clostridii, cum ar fi Clostridium beijerinckii, conțin Aldh și Adh individuale în loc de o enzimă bifuncțională pentru producția de butanol. Alternativ, Aldh se găsește în căile de degradare pentru etanolamină și 1,3-propandiol . Cu toate acestea, Aldh din operonii de utilizare a etanolaminei și 1,3-propandiolului nu sunt specifici pentru reducerea butiril-CoA și s-a demonstrat anterior că produce etanol atunci când este exprimat în E. coli . Prin urmare, pentru studiul de față, am ales să lucrăm cu Clostridium Aldh. Pe baza secvenței aldh de la C. beijerinckii, am selectat Doi omologi suplimentari de la C. saccharolyticum și C. saccharoperbutylacetonicum, precum și un aldh mutant de la C. beijerinckii pe care l-am izolat anterior în laboratorul nostru (Vezi fișierul suplimentar 1 pentru secvența sa). Aceste patru gene aldh au fost clonate individual în operoni sintetici cu genele necesare pentru a converti acetil-CoA în butiril-CoA (Fig. 1b). Acești operoni sintetici au fost conduși de promotorul nativ E. coli al genelor ack și adhE, respectiv Pack și PadhE, care s-au dovedit anterior că produc titruri mai mari de butanol comparativ cu utilizarea promotorului PLlacO1 inductibil IPTG . Aici pachetul și PadhE au fost definite pentru a include situsul de legare ribozomală și regiunea netradusă 5′ în amonte de genele lor corespunzătoare. atoB, aldh, crt și hbd au fost clonate ca un singur operon pe o plasmidă de origine colE1 sub controlul Pack. ter și fdh au fost exprimate individual pe plasmidele de origine colA și pSC101, respectiv, sub controlul PadhE . Aceste plasmide au fost transformate în tulpina de E. coli JCL299, care s-a dovedit anterior că produce eficient n-butanol și a eliminat ldhA, adhE, frdBC și pta . După eliminarea căilor mixte de fermentare acidă, JCL299 canalizează eficient acetil-CoA și NADH pentru sinteza n-butiraldehidei. Așa cum era de așteptat, datorită prezenței alcool dehidrogenazelor endogene, tulpinile rezultate au prezentat o producție minimă de n-butiraldehidă (Fig. 2a). Majoritatea produselor de fermentație a fost n-butanol peste tulpinile care exprimă cele patru gene aldh diferite. Yqhd cromozomial, care codifică alcoolul dehidrogenază dependent de NADPH, este cunoscut pentru a reduce aldehidele la alcoolii lor corespunzători și foarte activ ca mecanism de detoxifiere . Prin urmare, am eliminat yqhD în JCL299, producând tulpina ELeco1. Exprimând calea n-butiraldehidă în tulpina ELeco1, s-a observat producția de n-butiraldehidă. Cea mai bună tulpină ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22 a produs 0,16 g/l de n-butiraldehidă (Fig. 2b). Cu toate acestea, raportul aldehidă-alcool a fost de 0,39. Acest raport scăzut aldehidă-alcool indică prezența altor ADH native active capabile să reducă n-butiraldehida.

îmbunătățirea raportului aldehidă-alcool prin eliminarea alcoolului nativ dehidrogenaze

pentru a reduce formarea n-butanolului și a crește raportul aldehidă-alcool, am eliminat genele care codifică alte Adh native. Pe baza lucrărilor anterioare pentru producția de izobutiraldehidă, am șters opt gene adh care ar putea contribui la reducerea n-butiraldehidei: yjgB, fucO, eutg, ybbO, adhP, gldA, yahK și yghA. Aceste gene au fost selectate deoarece eliminarea lor a dus la titruri de producție mai mari de izobutiraldehidă. Am eliminat secvențial fiecare dintre aceste gene adh folosind transducția fagului P1 cu colecția Keio. Deoarece toate aceste gene adh s-au dovedit a fi eficiente pentru creșterea producției de izobutiraldehidă, acestea au fost eliminate fără o ordine specifică. Rezultatele titrurilor de producție de n-butiraldehidă și raportul aldehidă-alcool din aceste tulpini mutante sunt prezentate în Fig. 3. Am observat că titrurile obținute prin ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22 sunt comparabile cu cele obținute prin cererea de brevet publicată de la Easel Biotechnologies , care a utilizat o tulpină cu genotip identic. Cu toate acestea, deoarece titrurile de n-butanol nu au fost raportate în activitatea lor, raporturile butiraldehidă-butanol nu pot fi comparate. Cu toate acestea, aici am dus mai departe designul tulpinii și am arătat că eliminările suplimentare ale genelor native adh au dus la o reducere semnificativă a butanolului. Tulpina finală KS8/pKU48/pRW18/pRW22 a atins un raport aldehidă-alcool de 3,1, reprezentând o îmbunătățire de opt ori comparativ cu tulpina ELeco1/pKU48/pRW18 / pRW22. Aici am observat că tulpina KS7 adăpostind aceleași plasmide a atins un raport aldehidă-alcool ușor mai mare de 3,4. Cu toate acestea, diferența în raporturile aldehidă-alcool a fost în intervalul de eroare și nesemnificativă. Prin urmare, tulpina KS8 a fost utilizată pentru experimentele din aval. Printre cele opt adh suplimentare pe care le-am eliminat, eutG, ybbO și yghA nu au arătat niciun efect pentru creșterea raportului aldehidă-alcool. Toate celelalte eliminări adh au contribuit pozitiv la creșterea raportului aldehidă-alcool, indicând expresia lor nativă și capacitatea enzimelor corespunzătoare de a reduce n-butiraldehida. În timp ce raportul aldehidă-alcool a crescut cu fiecare genă adh eliminată, titrul de n-butiraldehidă nu a crescut semnificativ. În mod corespunzător, consumul de glucoză de către tulpini cu fiecare genă adh suplimentară knock out a scăzut, de asemenea (Fig. 3). Aceste rezultate indică faptul că fluxul de carbon a fost redus. Analiza termodinamicii fiecărei etape a relevat faptul că reducerea butiril-CoA la N-butiraldehidă este nefavorabilă termodinamic cu o valoare de 7,7 kJ/mol (calculată cu ajutorul echilibratorului ), ceea ce poate duce la conversia ineficientă a butiril-CoA în n-butiraldehidă, în special după ce concentrația de n-butiraldehidă a atins un anumit prag. Este probabil ca, pe măsură ce producția de n-butiraldehidă este încetinită, metabolismul glucozei încetinește și din cauza incapacității de reciclare a NADH. Din moment ce e nativ. genele de fermentare coli (adhE, frdBC și ldhA) au fost eliminate în tulpina KS8, producția de n-butiraldehidă devine singura cale fermentativă disponibilă pentru reciclarea NADH înapoi la NAD+. Când biosinteza n-butiraldehidei este încetinită, mai puțin NAD+ este disponibil pentru utilizare în glicoliză. Ca urmare, rata consumului de glucoză scade. Prin urmare, am investigat în continuare efectul eliminării in situ asupra titrului de producție de n-butiraldehidă.

îmbunătățirea titrului de n-butiraldehidă prin îndepărtarea produsului in situ

aici am ales să folosim extracția lichid–lichid in situ pentru îndepărtarea n-butiraldehidei folosind suprapunere organică. Dodecanul și alcoolul oleilic au fost selectați ca extractanți datorită aplicării lor generale și non-toxicității la culturile microbiene . Am determinat coeficientul de partiție al n-butiraldehidei în apă și cei doi solvenți organici prin măsurarea raportului n-butiraldehidei care apare atât în faza apoasă, cât și în cea organică (fișier suplimentar 1: Figura s2) după amestecare viguroasă urmată de incubare staționară la 37 C. coeficientul de partiție determinat pentru n-butiraldehidă a fost 0,141 și 0,764 pentru dodecan și, respectiv, alcool oleilic. Acest rezultat a indicat faptul că alcoolul oleilic poate fi un extractant mai potrivit pentru n-butiraldehidă, deoarece coeficientul de partiție mai mare indică raportul mai mare de n-butiraldehidă găsit în stratul organic. Acești doi extractanți sunt doar ușor toxici pentru E. coli, deoarece creșterea tulpinii producătoare de n-butiraldehidă cultivată în prezența fie a dodecanului, fie a alcoolului oleilic a fost doar ușor redusă în comparație cu martor fără extractant (Fig. 4a), indicând adecvarea acestor solvenți pentru extracția in situ. După cum arată rezultatele din Fig. 4B, titrul de n-butiraldehidă s-a îmbunătățit semnificativ în prezența extractantului. În mod consecvent atât pentru dodecan, cât și pentru alcoolul oleilic, utilizarea a 1 volum de extractant depășește acest volum folosind 0,5. Cea mai bună condiție folosind alcool oleilic cu un raport de volum extractant-cultură 1:1 a produs peste 0,6 g/L de n-butiraldehidă, reprezentând o îmbunătățire de aproape trei ori față de niciun extractant. Așa cum era de așteptat, alcoolul oleilic a depășit dodecanul ca extractant pentru n-butiraldehidă (Fig. 4c), în concordanță cu coeficienții de partiție.

efectul reducerii complexității mediilor asupra producției de n-butiraldehidă

în continuare, am evaluat efectul extractului de drojdie și al concentrației de triptonă asupra producției de n-butiraldehidă. Utilizarea bulionului teribil (TB) nu este de obicei viabilă din punct de vedere comercial datorită costului său scump. Mai mult, aldehidele sunt reactive și pot forma spontan baza Schiff cu amine. Deoarece TB conține cantități mari de extract de drojdie și triptonă, aldehidele pot reacționa spontan cu grupările amino prezente pe aminoacizi și oligopeptide din TB. Folosind medii M9 cu glucoză ca bază, suplimentăm 0 până la 2% extract de drojdie sau triptonă pentru a determina un nivel optim. Rezultatele sunt rezumate în Fig. 5. Figura 5a prezintă efectul concentrației extractului de drojdie asupra producției de n-butiraldehidă după 24 de ore de incubare anaerobă. titrul de N-Butiraldehidă nu a fost sensibil semnificativ la concentrația extractului de drojdie între 0,125 și 2%. Cu toate acestea, dacă nu s-a adăugat extract de drojdie, s-a observat doar o cantitate minimă de n-butiraldehidă, indicând importanța sursei complexe de azot. Interesant este că cei care folosesc M9 cu extract de drojdie au avut un raport aldehidă-alcool mai mare decât cel care utilizează TB datorită nivelurilor mai ridicate de butanol produs. 48-h comutator post-anaerob (Fig. 5b) a arătat o ușoară scădere a n-butiraldehidei și o creștere a titrului de n-butanol, indicând alcool dehidrogenază funcțională care transformă activ n-butiraldehida în n-butanol.

producția de N-Butiraldehidă a fost mai sensibilă la concentrația de triptonă decât cea a extractului de drojdie ca culturi conținând 0,125 și 0.25% triptonă a prezentat un titru mai mic de n-butiraldehidă comparativ cu concentrațiile corespunzătoare de extract de drojdie (Fig. 5c, d). Creșterea concentrației de triptonă a dus la creșterea producției de n-butanol, indicând faptul că triptona a contribuit la scăderea raportului aldehidă-alcool pentru utilizarea TB ca mediu de producție. Comparând componentele extractului de drojdie și triptonă din manualul producătorilor, am observat că triptona are un procent mai mare de molecule mai mari cu greutate moleculară în intervalul de peste 500-2000 Da, indicând o cantitate mai mare de oligopeptide. Pe de altă parte, extractul de drojdie conține în mare parte molecule mai mici, cu greutate moleculară mai mică de 250 Da. Este posibil ca această discrepanță să conducă la diferite modele de Expresie care pot include alcool dehidrogenaze native nespecifice capabile să reducă n-butiraldehida. Cu toate acestea, mecanismul exact al motivului pentru care triptona determină creșterea producției de n-butanol este neclar.