förnybar syntes av n-butyraldehyd från glukos av konstruerad Escherichia coli

val av CoA-acylerande aldehyddehydrogenas för N-butyraldehydproduktion

n-Butyraldehyd är en intermediär i Clostridium CoA-beroende n-butanolproduktionsväg (Fig. 1b). Bifunktionell aldehyd / alkoholdehydrogenas AdhE2 katalyserar emellertid den direkta tvåstegsomvandlingen av butyryl-CoA till n-butanol och kringgår n-butyraldehyd som en produkt. För att undvika omvandling av n-butyraldehyd till n-butanol ersatte vi först AdhE2 med CoA-acylerande aldehyddehydrogenas (Aldh), vilket katalyserar endast omvandlingen av butyryl-CoA till n-butyraldehyd. Vissa clostridier som Clostridium beijerinckii innehåller individuell Aldh och Adh istället för ett bifunktionellt enzym för butanolproduktion. Alternativt finns Aldh i nedbrytningsvägarna för etanolamin och 1,3-propandiol . Aldh från etanolamin och 1,3-propandiolutnyttjande operoner är emellertid inte specifika för butyryl-CoA-reduktion och har tidigare visat sig producera etanol när de uttrycks i E. coli . Därför valde vi för den aktuella studien att arbeta med Clostridium Aldh. Baserat på sekvensen av aldh från C. beijerinckii valde vi ytterligare två homologer från C. saccharolyticum och C. saccharoperbutylacetonicum, liksom en mutant aldh från C. beijerinckii som vi isolerade tidigare i vårt laboratorium (se ytterligare fil 1 för dess sekvens). Dessa fyra ALDH-gener klonades individuellt till syntetiska operoner med de gener som var nödvändiga för att omvandla acetyl-CoA till butyryl-CoA (Fig. 1b). Dessa syntetiska operoner drevs av nativ E. coli-promotor av ack-och adhE-gener, Pack respektive PadhE, som tidigare har visat sig producera högre titrar av butanol jämfört med att använda IPTG-inducerbar pllaco1-promotor . Här definierades Pack och PadhE för att inkludera det ribosomala bindningsstället och 5′ oöversatt region uppströms om deras motsvarande gener. atoB, aldh, crt och hbd klonades som en operon på en colE1-ursprungsplasmid under kontroll av Pack. ter och fdh uttrycktes individuellt på colA respektive psc101-ursprungsplasmider under kontroll av PadhE . Dessa plasmider transformerades till E. coli-stam JCL299 som tidigare visat sig effektivt producera n-butanol och har ldha, adhE, frdBC och pta slog ut . Med de blandade syrafermenteringsvägarna utslagen kanaliserar JCL299 effektivt acetyl-CoA och NADH för syntes av n-butyraldehyd. Som förväntat visade de resulterande stammarna på grund av närvaron av endogena alkoholdehydrogenaser minimal produktion av n-butyraldehyd (Fig. 2a). Majoriteten av fermentationsprodukterna var n-butanol över stammarna som uttryckte de fyra olika aldh-generna. Kromosomal yqhD, som kodar för NADPH-beroende alkoholdehydrogenas, är känt för att reducera aldehyder till motsvarande alkoholer och mycket aktiva som en avgiftningsmekanism . Därför slog vi ut yqhD i JCL299, vilket gav stam ELeco1. Att uttrycka n-butyraldehydvägen i stam ELeco1 observerades n-butyraldehydproduktion. Den bästa stammen ELeco1/pKU48/pRW18/pRW22 producerade 0,16 g / L n-butyraldehyd (Fig. 2b). Förhållandet mellan aldehyd och alkohol var emellertid 0,39. Detta låga aldehyd-till-alkohol-förhållande indikerar närvaron av annan aktiv nativ Adh som kan reducera n-butyraldehyd.

förbättra aldehyd-till-alkohol-förhållandet genom att slå ut inhemska alkoholdehydrogenaser

för att minska n-butanolbildning och öka aldehyd-till-alkohol-förhållandet slog vi ut generna som kodar för andra infödda Adh. Baserat på tidigare arbete för isobutyraldehydproduktion raderade vi åtta adh-gener som sannolikt kommer att bidra till n-butyraldehydreduktion: yjgB, fucO, eutG, ybbO, adhP, gldA, yahK och yghA. Dessa gener valdes eftersom deras knockouts ledde till högre produktionstitrar av isobutyraldehyd. Vi slog sekventiellt ut var och en av dessa adh-gener med hjälp av P1-fagtransduktion med Keio-samlingen. Eftersom alla dessa ADH-gener har visat sig vara effektiva för att öka isobutyraldehydproduktionen slogs de ut utan specifik ordning. Resultaten av n-butyraldehydproduktionstitrar och aldehyd-till-alkoholförhållandet från dessa mutanta stammar visas i Fig. 3. Vi noterade att titrarna som uppnåddes av ELeco1/pKU48/pRW18 / pRW22 är jämförbara med de som uppnåddes genom den publicerade patentansökan från Easel Biotechnologies , som använde en stam med identisk genotyp. Eftersom n-butanoltitrarna inte rapporterades i deras arbete, kan butyraldehyd-till-butanolförhållandena inte jämföras. Ändå tog vi här stamdesignen vidare och visade att ytterligare knockouts av inhemska adh-gener ledde till signifikant minskning av butanol. Den slutliga stammen KS8/pKU48/pRW18/pRW22 nådde ett aldehyd-till-alkoholförhållande på 3,1, vilket motsvarar en åttafaldig förbättring jämfört med stam ELeco1/pKU48/pRW18 / pRW22. Här noterade vi att Stam KS7 som hyser samma plasmider nådde något högre aldehyd-till-alkohol-förhållande på 3,4. Skillnaden i aldehyd-till-alkohol-förhållanden var emellertid inom felområdet och obetydlig. Därför användes stam KS8 för nedströms experiment. Bland de åtta ytterligare adh som vi slog ut visade eutG, ybbO och yghA ingen effekt för att öka förhållandet mellan aldehyd och alkohol. Alla andra ADH-knock-out bidrog positivt till att öka förhållandet mellan aldehyd och alkohol, vilket indikerar deras infödda uttryck och motsvarande enzymers förmåga att minska n-butyraldehyd. Medan aldehyd-till-alkohol-förhållandet ökade med varje adh-gen som slog ut, ökade inte titern av n-butyraldehyd signifikant. På motsvarande sätt minskade också glukosförbrukningen av stammar med varje ytterligare adh-gen (Fig. 3). Dessa resultat indikerar att kolflödet reducerades. Analys av termodynamiken i varje steg avslöjade att butyryl-CoA-reduktion till n-butyraldehyd är termodynamiskt ogynnsam med AUGG’-7,7 kJ/mol (beräknat med jämviktsmedel ), vilket kan leda till ineffektiv omvandling av butyryl-CoA till n-butyraldehyd, särskilt efter att n-butyraldehydkoncentrationen nått en viss tröskel. Det är troligt att när n-butyraldehydproduktionen bromsas, saktar glukosmetabolismen också på grund av oförmåga för NADH-återvinning. Sedan den infödda E. coli-fermentationsgener (adhE, frdBC och ldhA) har slagits ut i stam KS8, n-butyraldehydproduktion blir den enda fermentativa vägen som är tillgänglig för att återvinna NADH tillbaka till NAD+. När n-butyraldehydbiosyntesen saktas ner är mindre NAD + tillgängligt för användning vid glykolys. Som ett resultat minskar glukosförbrukningshastigheten. Därför undersökte vi nästa effekten av in situ-borttagning på N-butyraldehydproduktionstiter.

förbättra n-butyraldehyd titer genom in situ produkt borttagning

här valde vi att använda in situ vätska–vätskeextraktion för N-butyraldehyd borttagning med hjälp av organiska overlay. Dodekan och oleylalkohol valdes som extraktionsmedel på grund av deras allmänna tillämpning och icke-toxicitet för mikrobiella kulturer . Vi bestämde fördelningskoefficienten för n-butyraldehyd i vatten och de två organiska lösningsmedlen genom att mäta förhållandet mellan n-butyraldehyd som uppträder i både vattenhaltig och organisk fas (ytterligare fil 1: figur S2) efter kraftig blandning följt av stationär inkubation vid 37 kcal C. Den bestämda fördelningskoefficienten för n-butyraldehyd var 0,141 respektive 0,764 för dodekan respektive oleylalkohol. Detta resultat indikerade att oleylalkohol kan vara ett mer lämpligt extraktionsmedel för n-butyraldehyd eftersom högre Fördelningskoefficient indikerar det högre förhållandet n-butyraldehyd som finns i det organiska skiktet. Dessa två extraktionsmedel är endast milt giftiga för E. coli eftersom tillväxten av den n-butyraldehydproducerande stammen odlad i närvaro av antingen dodekan eller oleylalkohol endast sänktes något jämfört med kontrollen utan något extraktionsmedel (Fig. 4a), vilket indikerar lämpligheten av dessa lösningsmedel för in situ extraktion. Som resultat visas i Fig. 4B, n-butyraldehydtiter förbättrades signifikant i närvaro av extraktionsmedel. Konsekvent för både dodekan och oleylalkohol, med användning av 1 volym extraktant överträffar det med 0,5 volym. Det bästa tillståndet med användning av oleylalkohol med ett 1:1 extraktant-till-odlingsvolymförhållande producerat över 0,6 g/L n-butyraldehyd, vilket representerar en nästan trefaldig förbättring jämfört med inget extraktant. Som förväntat överträffade oleylalkohol dodekan som extraktant för n-butyraldehyd (Fig. 4c), i överensstämmelse med fördelningskoefficienterna.

effekt av att minska mediakomplexiteten på N-butyraldehydproduktion

därefter utvärderade vi effekten av jästextrakt och tryptonkoncentration på N-butyraldehydproduktion. Att använda fantastiskt buljong (TB) är vanligtvis inte kommersiellt lönsamt på grund av dess dyra kostnad. Vidare är aldehyder reaktiva och kan spontant bilda Schiff-bas med aminer. Eftersom TB innehåller stora mängder jästextrakt och trypton kan aldehyder sannolikt spontant reageras med de aminogrupper som finns på aminosyror och oligopeptider i TB. Med hjälp av M9-media med glukos som bas kompletterar vi 0 till 2% jästextrakt eller trypton för att bestämma en optimal nivå. Resultaten sammanfattas i Fig. 5. Figur 5a visar effekten av jästextraktkoncentration på produktionen av n-butyraldehyd efter 24 h anaerob inkubation. n-Butyraldehydtiter var inte signifikant känslig för jästextraktkoncentration mellan 0,125 och 2%. Om inget jästextrakt tillsattes observerades emellertid endast minimal mängd n-butyraldehyd, vilket indikerar vikten av komplex kvävekälla. Intressant nog hade de som använde M9 med jästextrakt ett högre aldehyd-till-alkoholförhållande än det som använde TB på grund av högre nivåer av producerad butanol. 48-timmars post-anaerob omkopplare (Fig. 5b) visade en liten minskning av n-butyraldehyd och ökning av n-butanoltiter, vilket indikerar funktionellt alkoholdehydrogenas som aktivt omvandlar n-butyraldehyd till n-butanol.

produktionen av N-Butyraldehyd var känsligare för tryptonkoncentration än för jästextrakt som kulturer innehållande 0,125 och 0.25% trypton visade lägre n-butyraldehydtiter jämfört med motsvarande koncentrationer av jästextrakt (Fig. 5c, d). Ökande tryptonkoncentration ledde till ökad n-butanolproduktion, vilket indikerar att trypton bidrog till det sänkta aldehyd-till-alkoholförhållandet för användning av TB som produktionsmedia. Genom att jämföra komponenterna i jästextrakt och trypton från tillverkarens manual märkte vi att trypton har högre andel större molekyler med molekylvikt i intervallet än 500-2000 Da, vilket indikerar en större mängd oligopeptider. Å andra sidan innehåller jästextrakt mestadels mindre molekyler med molekylvikt mindre än 250 Da. Det är möjligt att denna avvikelse ledde till olika uttrycksmönster som kan inkludera icke-specifika nativa alkoholdehydrogenaser som kan reducera n-butyraldehyd. Ändå är den exakta mekanismen för varför trypton orsakar ökning av n-butanolproduktionen oklart.