vedvarende syntese af n-butyraldehyd fra glucose ved konstrueret Escherichia coli

udvælgelse af CoA-acylerende aldehyddehydrogenase til N-butyraldehydproduktion

n-Butyraldehyd er et mellemprodukt i den Clostridium CoA-afhængige n-butanolproduktionsvej (Fig. 1b). Bifunktionel aldehyd / alkoholdehydrogenase AdhE2 katalyserer imidlertid den direkte totrinskonvertering af butyryl-CoA til n-butanol og omgår n-butyraldehyd som et produkt. For at undgå omdannelse af n-butyraldehyd til n-butanol erstattede vi først AdhE2 med CoA-acylerende aldehyddehydrogenase (Aldh) og katalyserede kun omdannelsen af butyryl-CoA til n-butyraldehyd. Nogle Clostridia såsom Clostridium beijerinckii indeholder individuelle Aldh og Adh i stedet for en bifunktionel f.eks butanol produktion. Alternativt findes Aldh i nedbrydningsvejene for ethanolamin og 1,3-propandiol . Aldh fra ethanolamin og 1,3-propandiol-udnyttelsesoperoner er imidlertid ikke specifikke for butyryl-CoA-reduktion og har tidligere vist sig at producere ethanol, når de udtrykkes i E. coli . Derfor valgte vi i den nuværende undersøgelse at arbejde med Clostridium Aldh. Baseret på sekvensen af aldh fra C. beijerinckii valgte vi to yderligere homologer fra C. saccharolyticum og C. saccharoperbutylacetonicum samt en mutant aldh fra C. beijerinckii , som vi tidligere isolerede i vores laboratorium (se yderligere fil 1 for dens sekvens). Disse fire aldh-gener blev individuelt klonet til syntetiske operoner med de gener, der var nødvendige for at omdanne acetyl-CoA til butyryl-CoA (Fig. 1b). Disse syntetiske operoner blev drevet af native E. coli-promotor af ack-og adhE-gener, henholdsvis Pack og PadhE, som tidligere har vist sig at producere højere titere af butanol sammenlignet med anvendelse af IPTG-inducerbar PLlacO1-promotor . Her blev pakningen og PadhE defineret til at omfatte det ribosomale bindingssted og 5′ uoversat region opstrøms for deres tilsvarende gener. atob, aldh, crt og hbd blev klonet som en operon på en colE1 Oprindelse plasmid under kontrol af Pack. ter og fdh blev udtrykt individuelt på henholdsvis colA-og psc101-oprindelsesplasmider under kontrol af PadhE . Disse plasmider blev omdannet til E. coli stamme JCL299, som tidligere blev vist at producere n-butanol effektivt og har ldhA, adhE, frdBC og pta slået ud . Når de blandede syrefermenteringsveje er slået ud, kanaliserer JCL299 effektivt acetyl-CoA og NADH til syntese af n-butyraldehyd. Som forventet viste de resulterende stammer på grund af tilstedeværelsen af endogene alkoholdehydrogenaser minimal produktion af n-butyraldehyd (Fig. 2a). Størstedelen af fermenteringsprodukterne var n-butanol på tværs af stammerne, der udtrykte de fire forskellige aldh-gener. Kromosomal ykhd, der koder for NADPH-afhængig alkoholdehydrogenase, er kendt for at reducere aldehyder til deres tilsvarende alkoholer og meget aktive som en afgiftningsmekanisme . Derfor slog vi ud ykhd i JCL299, hvilket gav belastning ELeco1. Udtrykker n-butyraldehydvejen i stamme ELeco1, n-butyraldehydproduktion blev observeret. Den bedste stamme ELeco1/pKU48/prv18/prv22 producerede 0,16 g / L n-butyraldehyd (Fig. 2b). Aldehyd-til-alkohol-forholdet var imidlertid 0,39. Dette lave aldehyd-til-alkohol-forhold indikerer tilstedeværelsen af andre aktive native Adh, der er i stand til at reducere n-butyraldehyd.

forbedring af aldehyd-til-alkohol-forholdet ved at slå ud native alkoholdehydrogenaser

for at reducere n-butanoldannelse og øge aldehyd-til-alkohol-forholdet, slog vi generne ud, der koder for andre native Adh. Baseret på tidligere arbejde med isobutyraldehydproduktion slettede vi otte adh-gener , der sandsynligvis vil bidrage til reduktion af N-butyraldehyd: yjgB, fucO, eutG, ybbO, adhP, gldA, yahK og yghA. Disse gener blev valgt, fordi deres knockouts førte til højere produktionstitere af isobutyraldehyd. Vi slog sekventielt hver af disse adh-gener ud ved hjælp af P1 fagtransduktion med Keio-samlingen. Da alle disse adh-gener har vist sig at være effektive til at øge isobutyraldehydproduktionen, blev de slået ud uden specifik rækkefølge. Resultaterne af N-butyraldehydproduktionstitere og aldehyd-til-alkohol-forholdet fra disse mutante stammer er vist i Fig. 3. Vi bemærkede , at titrene opnået ved ELeco1/pKU48/prv18/prv22 er sammenlignelige med dem, der opnås ved den offentliggjorte patentansøgning fra Easel Biotechnologies, der anvendte en stamme med identisk genotype. Da n-butanoltiterne imidlertid ikke blev rapporteret i deres arbejde, kan butyraldehyd-til-butanol-forholdet ikke sammenlignes. Ikke desto mindre tog vi her stammedesignet videre og viste, at yderligere knockouts af native adh-gener førte til signifikant reduktion i butanol. Den endelige stamme KS8/pKU48/prv18/prv22 nåede et aldehyd-til-alkohol-forhold på 3,1, hvilket repræsenterer en ottefoldig forbedring sammenlignet med stammen ELeco1/pKU48/prv18 / prv22. Her bemærkede vi, at stamme KS7, der huser de samme plasmider, nåede lidt højere aldehyd-til-alkohol-forhold på 3,4. Forskellen i aldehyd-til-alkohol-forhold var imidlertid inden for fejlområdet og ubetydelig. Derfor blev stamme KS8 anvendt til nedstrøms eksperimenter. Blandt de otte ekstra adh, som vi slog ud, viste eutG, ybbO og yghA ingen effekt for at øge aldehyd-til-alkohol-forholdet. Alle andre ADH-knock-out bidrog positivt til at øge aldehyd-til-alkohol-forholdet, hvilket indikerer deres oprindelige ekspression og tilsvarende evne til at reducere n-butyraldehyd. Mens aldehyd-til-alkohol-forholdet steg med hvert adh-gen knock out, steg titeren af n-butyraldehyd ikke signifikant. Tilsvarende faldt glukoseforbruget ved stammer med hvert yderligere adh-gen også (Fig. 3). Disse resultater indikerer, at kulstofstrømmen blev reduceret. Analyse af termodynamikken i hvert trin afslørede, at butyryl-CoA-reduktion til n-butyraldehyd er termodynamisk ugunstig med LENGG’ purpur på 7,7 kJ/mol (beregnet ved hjælp af ækvilibrator), hvilket kan føre til ineffektiv omdannelse af butyryl-CoA til n-butyraldehyd, især efter at n-butyraldehydkoncentrationen nåede en bestemt tærskel. Det er sandsynligt, at da produktionen af N-butyraldehyd sænkes, sænkes glukosemetabolismen også på grund af manglende evne til NADH-genanvendelse. Siden den indfødte E. coli-fermenteringsgener (adhE, frdBC og ldhA) er blevet slået ud i stamme KS8, n-butyraldehydproduktion bliver den eneste fermentative vej, der er tilgængelig til at genbruge NADH tilbage til NAD+. Når n-butyraldehydbiosyntesen sænkes, er mindre NAD+ tilgængelig til brug ved glykolyse. Som følge heraf falder glukoseforbrugshastigheden. Derfor undersøgte vi derefter effekten af in situ-fjernelse på N-butyraldehydproduktionstiter.

forbedring af N-butyraldehyd titer ved in situ produktfjernelse

her valgte vi at bruge in situ væske–væske ekstraktion til fjernelse af N-butyraldehyd ved hjælp af organisk overlay. Dodecan og oleylalkohol blev udvalgt som ekstraktionsmidler på grund af deres generelle anvendelse og ikke-toksicitet for mikrobielle kulturer . Vi bestemte fordelingskoefficienten for n-butyraldehyd i vand og de to organiske opløsningsmidler ved at måle forholdet mellem n-butyraldehyd, der forekommer i både vandig og organisk fase (yderligere fil 1: Figur S2) efter kraftig blanding efterfulgt af stationær inkubation ved 37 liter C. Den bestemte fordelingskoefficient for n-butyraldehyd var henholdsvis 0,141 og 0,764 for dodecan og oleylalkohol. Dette resultat indikerede, at oleylalkohol kan være et mere egnet ekstraktionsmiddel til n-butyraldehyd, da højere fordelingskoefficient indikerer det højere forhold mellem n-butyraldehyd, der findes i det organiske lag. Disse to ekstraktionsmidler er kun mildt toksiske for E. coli, da væksten af den n-butyraldehydproducerende stamme dyrket i nærværelse af enten dodecan eller oleylalkohol kun blev lidt sænket sammenlignet med kontrollen uden noget ekstraktionsmiddel (Fig. 4a), der angiver egnetheden af disse opløsningsmidler til in situ-ekstraktion. Som resultaterne vist i Fig. 4B, n-butyraldehydtiter forbedredes signifikant i nærvær af ekstraktionsmiddel. Konsekvent for både dodecan og oleylalkohol overstiger brugen af 1 volumen ekstraktionsmiddel det, der bruger 0,5 volumen. Den bedste tilstand ved anvendelse af oleylalkohol med et 1: 1 ekstraktionsmiddel-til-kultur volumenforhold produceret over 0,6 g/L n-butyraldehyd, hvilket repræsenterer en næsten tredobbelt forbedring i forhold til intet ekstraktionsmiddel. Som forventet overgik oleylalkohol dodecan som ekstraktionsmiddel til n-butyraldehyd (Fig. 4c), i overensstemmelse med fordelingskoefficienterne.

effekt af at reducere mediekompleksitet på N-butyraldehydproduktion

dernæst vurderede vi effekten af gærekstrakt og tryptonkoncentration på N-butyraldehydproduktion. Brug af fantastisk bouillon (TB) er typisk ikke kommercielt levedygtig på grund af dens dyre omkostninger. Endvidere er aldehyder reaktive og kan spontant danne Schiff-base med aminer. Da TB indeholder store mængder gærekstrakt og trypton, kan aldehyder sandsynligvis reageres spontant med de aminogrupper, der er til stede på aminosyrer og oligopeptider i TB. Ved hjælp af M9-medier med glukose som base supplerer vi 0 til 2% gærekstrakt eller trypton for at bestemme et optimalt niveau. Resultaterne er opsummeret i Fig. 5. Figur 5a viser virkningen af koncentrationen af gærekstrakt på produktionen af N-butyraldehyd efter 24 timers anaerob inkubation. n-Butyraldehydtiter var ikke signifikant følsom over for gærekstraktionskoncentration mellem 0,125 og 2%. Men hvis der ikke blev tilsat gærekstrakt, blev der kun observeret minimal mængde n-butyraldehyd, hvilket indikerer vigtigheden af kompleks nitrogenkilde. Interessant nok havde de, der brugte M9 med gærekstrakt, et højere aldehyd-til-alkohol-forhold end det, der brugte TB på grund af højere niveauer af produceret butanol. 48-h post-anaerob kontakt (Fig. 5b) viste et let fald i n-butyraldehyd og stigning i n-butanoltiter, hvilket indikerer funktionel alkoholdehydrogenase, der aktivt omdanner n-butyraldehyd til n-butanol.

n-Butyraldehydproduktionen var mere følsom over for tryptonkoncentration end gærekstraktet som kulturer indeholdende 0,125 og 0.25% trypton viste lavere n-butyraldehydtiter sammenlignet med de tilsvarende koncentrationer af gærekstrakt (Fig. 5c, d). Stigende tryptonkoncentration førte til øget n-butanolproduktion, hvilket indikerer, at trypton bidrog til det nedsatte aldehyd-til-alkohol-forhold til brug af TB som Produktionsmedier. Ved at sammenligne komponenterne i gærekstrakt og trypton fra producentens manual bemærkede vi, at trypton har højere procentdel af større molekyler med molekylvægt i området end 500-2000 Da, hvilket indikerer en større mængde oligopeptider. På den anden side indeholder gærekstrakt for det meste mindre molekyler med molekylvægt mindre end 250 Da. Det er muligt, at denne uoverensstemmelse førte til forskellige ekspressionsmønstre, som kan omfatte ikke-specifikke native alkoholdehydrogenaser, der er i stand til at reducere n-butyraldehyd. Ikke desto mindre er den nøjagtige mekanisme til, hvorfor trypton forårsager stigning i n-butanolproduktion, uklar.