LC3-positive Strukturen sind in Autophagie-defizienten Zellen prominent

Materialien

Die in dieser Studie verwendeten Antikörper sind: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) und alle Alexa-konjugierten Sekundärantikörper wurden von Invitrogen bezogen. Die Konstrukte pEGFP-LC3, pEGFP-LC3-G120A und RFP-LC3 waren freundliche Geschenke von Dr. T. Yoshimori (Universität Osaka, Japan). ATG9A-pEGFP war ein freundliches Geschenk von Dr. Y. Takahashi (Penn State College of Medicine, USA), C1-mCherry war von Clontech (632524), mCherry-p62 und mCherry-p62 LIR Mutant (DDDW335-338AAAA) war ein freundliches Geschenk von Dr. Sascha Martens (Universität Wien, Österreich), p62-pEGFP war ein freundliches Geschenk von Dr. Terje Johansen (Artic University, Norwegen), während Myc-LC3-G120A-ΔC22 ein Geschenk von Dr. T. Yoshimori (Addgene Plasmid # 45449) war. Das pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 war ein Geschenk von Dr. F. Zhang (Addgene Plasmid # 62988). pCMV-ATG7 war ein freundliches Geschenk von Dr. Isei Tanida. EGFP-LC3K51A und EGFP-LC3F52A wurden durch Site-Mutagenese unter Verwendung des Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB E0554S) und EGFP-LC3 als Vorlage gemäß den Anweisungen des Herstellers erstellt. Verwendete Primer für die K51A-Mutation: 5′-ccgtcctggacaagaccgcgttccttgtacctgatc-3′ und für die F52A-Mutation: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.

Zellkultur

HeLa-Zellen wurden in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) kultiviert, das mit 10% v/v fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin und 2 mM L-Glutamin ergänzt wurde. HepG2-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium gehalten, ergänzt mit 10% v / v fetalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin-Streptomycin, alle von Sigma, UK, erhalten. Die Zelllinien wurden durch Passage der Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung (Sigma) aufrechterhalten, nachdem sie in T75-Flaschen (75 cm2 Fläche) (Falcon) zu etwa 75-90% subkonfluent waren. Die für diese Studie verwendete Zelllinie war die HeLa-Zelllinie (Human Cervical Cancer Cells). In Experimenten, in denen wir den autophagischen Fluss blockieren mussten, wurden Zellen mit 400 nM Bafilomycin A1 für 4 Stunden bei 37 ° C behandelt.

Transfektion

Die HeLa-Zellen wurden mit dem gereinigten Plasmid unter Verwendung des Mirus TransIT-2020 Transfektionsreagenz transfiziert. Die Transfektion wurde unter Verwendung des OptiMem-Mediums unter Verwendung des Herstellerprotokolls durchgeführt. Kurz wurde eine Mischung von 100 µl OptiMem mit 1 µg DNA hergestellt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Eine weitere Mischung enthaltend 100 µl OptiMem mit 5 µl Mirus wurde hergestellt und 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurden beide Lösungen miteinander vermischt und ca.20-25 Minuten inkubiert. Das Gesamtvolumen wurde dann in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte gegeben, die bereits 1 ml OptiMem enthielt. Die Menge an DNA, die im Allgemeinen für die Transfektion verwendet wurde, betrug 1 µg für ein 6-Well.

siRNA-vermittelter Knockdown

Die Zellen für den siRNA-Knockdown wurden mit lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz transfiziert. Die Transfektion wurde unter Verwendung des OptiMem-Mediums unter Verwendung des Herstellerprotokolls durchgeführt. Kurz wurde eine Mischung aus 100 µl OptiMem mit 3 µl 20 µM oder 1 µl 100 µM siRNA hergestellt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Gleichzeitig wurde eine weitere Mischung enthaltend 100 µl OptiMem mit 5 µl Lipofectamin 2000 hergestellt und 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurden beide Lösungen miteinander vermischt und ca.20-25 Minuten inkubiert. Das Gesamtvolumen wurde dann zu einer Vertiefung einer 6-Well-Platte, die bereits 1 ml OptiMem enthielt, für 4 Stunden bei 37°C gegeben. Nach der Inkubation wurden die Medien gewechselt und durch Vollmedien ersetzt. Die Zellen wurden dann nach 48 Stunden Inkubation geerntet, wenn ein einzelner Knockdown (KD) gewünscht wurde, wie für die ATG7- und ATG10-KD in HeLa-Zellen. Für die ATG7- und ATG10-Rettungsexperimente wurde eine pcDNA.3 (leerer Vektor) oder ATG7 plus ATG10-FLAG wurden verwendet, um Zellen 24 Stunden nach der siRNA-Transfektion zu transfizieren. Für Doppel-KD-Studien führten wir nach der ersten Runde (für p62-KD-Studien) eine weitere Runde der siRNA-Transfektion nach demselben Protokoll wie oben erwähnt durch. Für den siRNA-Knockdown in HepG2-Zellen wurden diese mit Lipofectamin RNAi max Transfektionsreagenz unter Verwendung von 100 nM final siRNA transfiziert und zwei Runden siRNA-Transfektion durchgeführt, um einen effizienten Knockdown zu erreichen. Die Zellen wurden dann gespalten und für weitere Experimente auf entsprechende Platten oder Deckgläser ausgesät. Die verschlüsselte siRNA (ON-TARGETplus Nicht-Targeting-Pool, D-001810-10), human ON-TARGETplus SQSTM1 (SmartPool, L-010230-00-0005 ), human ON-TARGETplus ATG7 (SmartPool, L-020112-00), human ON-TARGETplus ATG10 (SmartPool, L-019426-01) wurden bei Dharmacon bestellt und in einer Endkonzentration von 50-100 nM eingesetzt.

GFP-Trap-Assays

HeLa-Zellen wurden mit EGFP-LC3 unter Verwendung von Mirus TransIT-2020 Transfektionsreagenz transfiziert und 24 Stunden später in Lysepuffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1) lysiert.5 mM MgCl2, 5 mM EGTA) 10 min auf Eis und 10 min bei 13.000 U/min pelletiert. GFP-markierte Proteine (EGFP oder EGFP-LC3) wurden unter Verwendung von GFP-TRAP-Beads (ChromoTek) gemäß dem Herstellerprotokoll heruntergezogen. Immunpräzipitate wurden eluiert, indem die Proben 5 min in Laemmli-Puffer gekocht wurden. Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgelöst.

Immunfluoreszenz

Die Immunzytochemie wurde an Zellen durchgeführt, die auf 22 × 22 mm Deckgläsern gezüchtet wurden. HeLa-Zellen wurden bei einer Konfluenz von 70-80% gezüchtet, einmal mit PBS gewaschen und dann entweder mit 4% w / v PFA für 5-7 Minuten oder Kalt-Methanol für 3-5 Minuten bei 4 ° C fixiert. Bitte beachten Sie, dass, da die meisten der in der Studie verwendeten Antikörper nur nach PFA-Fixierung wirkten, die Proben im Allgemeinen mit 4% w / v PFA in PBS fixiert wurden, sofern in den Figurenlegenden nicht anders angegeben. PFA wurde entsprechend den Sicherheitsvorschriften verworfen und die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 0 permeabilisiert.5% v/v Triton X-100 für 5-7 minuten und gewaschen drei mal mit PBS zu entfernen jede rest waschmittel. Anschließend wurde eine 1% w/v BSA enthaltende Lösung als Blockierungslösung auf die Deckgläser gegeben, um die unspezifische Bindung der primären und sekundären Antikörper zu reduzieren, und 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Anschließend wurde die Blockierungslösung von den Deckgläsern abgezapft und die Primärantikörper in entsprechenden Verdünnungen auf die Deckgläser gegeben. Die Deckgläser mit Primärantikörpern wurden 16-20 Stunden bei 4 °C in einer feuchten und feuchten Kammer inkubiert. Die Deckgläser wurden anschließend dreimal mit PBS gewaschen und mit einer Lösung, die Sekundärantikörper enthielt, 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. (Beachten Sie, dass die primären und sekundären Antikörperlösungen im Blockierpuffer hergestellt wurden.) Die Verdünnung der für diese Studie verwendeten Sekundärantikörper betrug 1:400, hergestellt in 1% w/v BSA-Lösung. Schließlich wurden Deckgläser zweimal mit PBS und hochreinem sterilem Wasser gewaschen und mit Pro-Long gold Anti-Fade DAPI-Montagemedium (Invitrogen, USA) auf Objektträger montiert. Die Deckgläser wurden dann mit dem Konfokalmikroskop Zeiss LSM880 oder LSM780 unter Verwendung des Ölimmersionsobjektivs 63x abgebildet.

Live-cell Imaging

ATG16L1-Knockout-Zellen wurden auf die MatTek-Schalen (MatTek, Ashland, USA) ausgesät. Am folgenden Tag wurden diese Zellen mit geeigneten Plasmid basierend auf experimentellen Anforderungen mit Mirus Trans-IT 2020 Transfektionsreagenz transfiziert. Die Transfektion wurde unter Verwendung des OptiMem-Mediums unter Verwendung des Herstellerprotokolls durchgeführt. Anschließend wurde eine 2% ige Triton X-100 Stammlösung verwendet, um die vorgesehene Konzentration für die Detergenzienextraktion der Plasmamembran zu erreichen. Eine Endkonzentration von 1% Triton X-100 ist in der Lage, das zytosolische und membrangebundene zu extrahieren. Das Experiment zur Bestätigung des Vorhandenseins von p62-Aggregaten in ATG16L1-Knockout-Zellen beinhaltete jedoch eine Detergensextraktion unter Verwendung von 1,5% Triton X-100 als Endkonzentration, um die Zellen härteren Extraktionsbedingungen auszusetzen. Die Bildgebung wurde dann unter Verwendung des ‚Time Series‘ -Moduls an einem inkubierten Zeiss AxioObserver Z1-Mikroskop mit einem Konfokalmikroskop LSM780 unter Verwendung einer 63 × 1,4 NA-Plan-Apochromat-Ölimmersionslinse durchgeführt.

Super-Resolution microscopy

Die Proben wurden auf Zeiss High precision No 1.5 170+ oder -5 µm, 18 mm × 18 mm Deckgläser ausgesät. Nach der Färbung wurden die Proben in Pro-Long Gold Anti-Fade DAPI-Montagemedium (Life Technologies) montiert und 3 Tage aushärten gelassen, um einen konstanten Brechungsindex (RI) von 1,46 zu erreichen. Die Proben wurden mit strukturierter Beleuchtung auf der Elyra PS1 (Carl Zeiss Microscopy) abgebildet. Nach der Stufenausrichtung wurden Laserlinien von 405, 488 und 561 nm verwendet, um einen Perlstapel abzubilden, um die chromatische Aberration unter Verwendung des Kanalausrichtungsalgorithmus zu korrigieren. Z-Stacks wurden in 5 Phasen und 5 Umdrehungen des Beleuchtungsgitters aufgenommen und anschließend mit der Software ZEN Black Elyra edition (Carl Zeiss Microscopy) bearbeitet und ausgerichtet.

Extraktion löslicher und unlöslicher Fraktionen

Die Extraktion der löslichen und unlöslichen Fraktionen aus ATG16L1-Knockout-Zellen wurde in RIPA-Puffer durchgeführt. Kurz wurden die Zellen einmal mit 1X eiskaltem PBS gewaschen und abgekratzt, in 500 µl RIPA-Puffer lysiert und in markierten, auf Eis gehaltenen Röhrchen gesammelt. Die Zusammensetzung des RIPA-Puffers war wie folgt –

RIPA-Puffer

50 mM Tris-HCl (pH 7,4)

150 mM NaCl

5 mM EDTA

1% Triton X-100

0.5% Natriumdeoxycholat

0.1% SDS

Zum Zeitpunkt der Anwendung wurde der RIPA-Puffer mit einer vollständigen Proteaseinhibitortablette (1 Tablette pro 50 ml) und den Phosphataseinhibitorcocktails 2 und 3 (jeweils 1:100) ergänzt.

Anschließend wurden die Lysate 10 mal durch eine 25 G Nadel geleitet und anschließend die Lösung bei 14000 upm für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand in einem frischen Eppendorf-Röhrchen gesammelt und als lösliche Fraktion markiert und mit 300 µl 2X Laemmli-Puffer versetzt und 5 Minuten gekocht. Das nach Zentrifugation erhaltene Pellet besteht aus der unlöslichen Fraktion und wurde resuspendiert und mit 500 µl RIPA-Puffer gewaschen. Die resuspendierte Lösung wurde anschließend bei 14000 rpm für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 100 µl HARNSTOFF + RIPA-Puffer resuspendiert. Diese wurde schließlich mit 100 µl 2X Laemmli-Puffer versetzt und 5 Minuten gekocht. Die Zusammensetzung von UREA + RIPA-Puffer besteht aus zusätzlichem Harnstoff in einer Endkonzentration von 2 M zusammen mit den Komponenten von RIPA-Puffer.

Western Blot

In 6-Well-Platten kultivierte Zellen wurden lysiert und in 2X Laemmli-Puffer (4% w/v SDS, 20% v/v Glycerin, 10% v/v 2-Mercaptoethanol, 0,004% w/v Bromphenolblau und 125 mM Tris HCl, pH 6,8) gesammelt. Nachdem die Zellen lysiert waren, wurden 20-30 µl der Proben auf eine 10-Well, 12-15% ige SDS-PAGE geladen und bei 100-120 V betrieben. Anschließend wurden die Proteine 60 Minuten bei 100 V auf das aktivierte PVDF übertragen. Nach beendetem Transfer wurde die Membran entfernt und 1 Stunde bei Raumtemperatur in 5 gew.-%iger Magermilch zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen getränkt. Anschließend wurde eine Lösung mit spezifischem Primärantikörper (hergestellt in 5% w/v Magermilch) in einer geeigneten Verdünnung zur nächtlichen Inkubation bei 4 °C auf die Membran gegeben. Die Membranen wurden dann dreimal mit PBST (Phosphatpuffer-Kochsalzlösung +0,1% Tween-20) vor der Zugabe von Sekundärantikörper gewaschen. Der Sekundärantikörper, ebenfalls hergestellt in 5% w/v Magermilch, wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur mit der Membran inkubiert. Die Verdünnung des Sekundärantikörpers wurde im Allgemeinen bei 1: 4000 für verbesserte Chemilumineszenz (ECL) HRP-konjugierte Antikörper und 1: 5000 für LICOR Fluorophor-konjugierte Antikörper gehalten. Anschließend wurden die Membranen erneut mehrfach mit PBST gewaschen und mit einer Mischung gleicher Volumina der Entwicklungslösungen 1 und 2 für ECL entwickelt oder direkt zur Fluoreszenzsignaldetektion mit der LICOR Image Studio Software (LICOR, US) abgebildet.

CRISPR Knockout cell generation

Die Guide-RNAs wurden für die Generierung von ATG9 Knockout-Zellen mit dem vom Zhang Lab entwickelten Online-Tool entwickelt21. Die drei wichtigsten Single Guide RNA (sgRNA) -Treffer wurden manuell modifiziert, um BbsI-Restriktionsstellen hinzuzufügen, und diese sgRNA-Sequenzen mit entsalzter Reinheit wurden bei Invitrogen bestellt. Die erfolgreich für ATG9 CRISPR Knockout verwendete Sequenz war:

Die hervorgehobenen Nukleotide zeigen die hinzugefügten Überhänge an. Die sgRNA wurde dann im psCas9-2A-Puromycin-Rückgrat ligiert. Die erfolgreich ligierten Plasmide bzw. die leere Cas9-Vektorkontrolle wurden dann in HeLa-Zellen transfiziert und die Expression 24 Stunden zugelassen. Transfizierte Zellen wurden dann durch Zugabe von Puromycin zu den Zellen in einer Endkonzentration von 2-4 µg / ml selektiert. Die Zellen durften wachsen, bis alle nicht transfizierten Zellen tot waren. Anschließend wurden die positiven Zellen trypsinisiert und die Zellzahl mit Invitrogen Countess Objektträgern (10 µl homogene Zellsuspension +10 µl Trypanblau) bestimmt. Basierend auf der lebenden Zellpopulation wurden 0,2 × 104 Zellen aspiriert und seriell in einer 96-Well-Platte verdünnt, um Einzelzellkolonien zu erhalten. Die serielle Verdünnung war immer 1:1 und das Endvolumen in jeder Vertiefung am Ende der Verdünnung wurde auf 200 µl gehalten. Die Zelllysate wurden dann auf SDS-PAGE geladen, auf eine Membran übertragen, um den Knock-out von ATG9 zu überprüfen.

Quantifizierung von Daten und statistische Analyse

Die Bilder wurden mit dem Standard-Plugin ‚Analyze particles‘ in ImageJ quantifiziert. Zusätzlich wurden die co-lokalisierten Pixel identifiziert und ein Profil mithilfe eines unbeaufsichtigten ImageJ-Plugin-Algorithmus namens ‚colocalization‘ generiert, der von Pierre Bourdoncle (Institut Jacques Monod, Service Imagerie, Paris) entwickelt wurde; 2003–2004). Die Western Blots wurden mit der Software LICOR Image Studio (LICOR, USA) quantifiziert und die Werte mit dem Excel-Programm aus der Microsoft Office-Suite verarbeitet, analysiert und aufgetragen.

Die statistischen Signifikanzniveaus für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit ein- oder zweischwänzigen T-Tests geschätzt. Für das Experiment mit ATG7 und ATG10 KD wurde ein einseitiger T-Test verwendet, um die statistische Signifikanz der Daten zu bewerten. Für alle anderen Experimente in dieser Studie wurde ein zweiseitiger T-Test verwendet, um die statistische Signifikanz der Daten zu bewerten. In diesem Artikel wurde der Wert von p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen, und die Konventionen zur Darstellung der Ergebnisse in diesem Artikel lauten wie folgt: * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001 und Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar, sofern nicht anders angegeben.