LC3-as estruturas positivas são proeminentes em células com deficiência de autofagia

materiais

os anticorpos utilizados neste estudo são:: mouse anti-LC3B clone 5F10 (0231-100, NanoTools), rabbit anti-LC3B (EPR18709, Abcam), rabbit anti-LC3B for western blotting (NB100-2220, Novus biologicals) , mouse anti-p62 (610832/3, BD Biosciences), rabbit anti-p62 (PM045, MBL), mouse anti-GFP (A6455, Invitrogen), rabbit anti-RAB11 (715300, Invitrogen), mouse anti-EEA1 (ab70521, Abcam), rabbit anti-ATG9A (ab108338, Abcam), mouse anti-tubulin (T9026, Sigma), rabbit anti-ATG7 (ab52472, Abcam), rabbit anti-ATG10 (ab124711, Abcam), rabbit anti-ATG16L1 (D6D5, AB_10950320, Cell Signaling), rabbit anti-ATG16L1 (PM040, MBL), mouse anti-GAPDH (ab2107448, Abcam) e todos os anticorpos secundários conjugados com Alexa foram comprados a partir de Invitrogénio. Os construtos pEGFP-LC3, pEGFP-LC3-G120A e RFP-LC3 foram gentis presentes do Dr. T. Yoshimori (Universidade de Osaka, Japão). ATG9A-pEGFP, foi uma espécie de presente do Dr. Y. Takahashi (Penn State College of Medicine, USA), C1-mCherry foi de Clontech (632524), mCherry-p62 e mCherry-p62 LIR mutante (DDDW335-338AAAA) foi uma espécie de presente do Dr. Sascha Martens (Universidade de Viena, Áustria), p62-pEGFP, foi uma espécie de presente do Dr. Terje Johansen (Artic University, Noruega), enquanto Myc-LC3-G120A-ΔC22 foi um presente do Dr. T. Yoshimori (addgene plasmid # 45449). O pSpCas9 (BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 foi um presente do Dr. F. Zhang (plasmídeo Addgene # 62988). o pCMV-ATG7 foi um bom presente do Dr. Isei Tanida. O EGFP-LC3K51A e o EGFP-LC3F52A foram criados por mutagénese local utilizando o kit de mutagénese local Q5 (NEB E0554S) e o pEGFP-LC3 como modelo de acordo com as instruções do fabricante. Iniciadores utilizados para a mutação K51A: 5′-ccgtcctgacaagaccgctttcttgtacctgatc-3′ e para a mutação F52A: 5′-gtcctggacaagaccaaggcccttgtacctgatcacgt-3′. For creating the GFP-GABARAP-GA and GFP-GABARAPL1-GA we first generated GFP-GABARAP and GFP-GABARAPL1 by cloning the respective coding sequences (ordered from GeneScript) onto the pEGFP-C1 backbone (Clontech). Primer sequences used for GFP-GABARAP: 5′-CCCGAATTCCATGAAGTTCGTGTACAAAGA-3′ and 5′-CCCGGAT CCTCACAGACCGTAGACACTTTC-3′, for GFP-GABARAPL1: 5′-CCCGAATTCC ATGAAGTTCCAGTACAAGGA-3′ and 5′-CCCGGATCCTCATTTCCCATAGACAC TCTC-3′. The lipidation deficient mutants were made by introducing G116A (for GABARAP) and G142A (for GABARAPL1) mutations using the Q5 Site-Directed Mutagenesis kit (NEB E0554S) according to the manufacturer’s instructions. For GFP-GABARAP-G116A primers used were: 5′-AGTGTCTACGcTCTGTGAGGATC-3′ and 5′-TTCGTCACTGTAGG CAATG-3′. For GFP-GABARAPL1-G142A primers used were: 5′-CTTACATATGcCAGTGTAAGGC-3′ and 5′-AGGATCCGGATAAATAAC-3′.Culturas celulares

culturas celulares

as células HeLa foram cultivadas no meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suplementadas com soro fetal bovino a 10% V/v, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina e 2 mM de L-glutamina. As células HepG2 foram mantidas no meio RPMI 1640, completadas com soro fetal bovino a 10% V/v, estreptomicina a 100 U/ml de penicilina, todas obtidas a partir de Sigma, Reino Unido. As linhas celulares foram mantidas através da passagem das células, usando a solução de Tripsin-EDTA (Sigma), depois que elas são sub-confluentes para cerca de 75-90% em balões de 75 cm2 (Falcon). A linha celular utilizada para este estudo foi a linha celular HeLa (células do cancro do colo do útero humano). Em experimentos onde precisávamos para bloquear autophagic fluxo, as células foram tratadas com 400 nM de bafilomycin A1 por 4 horas a 37 °C.

Transfection

As células HeLa foram transfected com o plasmídeo purificado utilizando o Mirus de Trânsito-2020 transfection reagent. A transfecção foi realizada utilizando o meio optiMEM, usando o protocolo do fabricante. Brevemente, foi preparada e incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos uma mistura de 100 µl de optiMEM com 1 µg de ADN. Outra mistura contendo 100 µl optiMEM com 5 µl de Mirus foi preparada e incubada durante 5 minutos. Ambas as soluções foram então misturadas e incubadas por aproximadamente 20-25 minutos. O volume total foi então adicionado a um poço de uma placa de 6 poços, contendo já 1 ml de optiMEM. A quantidade de ADN geralmente utilizada para transfecção foi de 1 µg para um poço de 6.

knockdown mediado por siRNA

as células para knockdown por siRNA foram transfectadas usando reagente de transfecção de lipofectamina 2000. A transfecção foi realizada utilizando o meio optiMEM, usando o protocolo do fabricante. Brevemente, foi preparada e incubada à temperatura ambiente durante 5 minutos uma mistura de 100 µl de optiMEM com 3 µl de 20 µM ou 1 µl de siRNA de 100 µM. Simultaneamente, foi preparada e incubada durante 5 minutos outra mistura contendo 100 µl optiMEM com 5 µl de Lipofectamina 2000. Ambas as soluções foram então misturadas e incubadas por aproximadamente 20-25 minutos. O volume total foi então adicionado a um poço de uma placa de 6 poços, contendo já 1 ml de optiMEM durante 4 horas a 37 ° C. Após a incubação, a mídia foi alterada e substituída pela mídia completa. As células foram então colhidas após 48 horas de incubação se um único knockdown (KD) foi desejado, como para o ATG7 e ATG10 KD em células HeLa. Para os experimentos de resgate ATG7 e ATG10, um pcDNA.3 (vetor vazio) ou ATG7 mais ATG10-FLAG foram usados para transfetar células 24 horas após a transfeção de siRNA. Para estudos em dupla KD, realizamos outra rodada de transfecção de siRNA, seguindo o mesmo protocolo mencionado acima, após a primeira rodada (para estudos em p62 KD). Para knockdown siRNA em células HepG2, estas foram transfectadas usando reagente de transfecção RNAi max Lipofectamina usando 100 nM siRNA final e duas rodadas de transfeção siRNA foram realizadas para alcançar um knockdown eficiente. As células foram então divididas e semeadas com as respectivas placas ou tampas para novos experimentos. O mexidos siRNA (NO TARGETplus Não-segmentação Piscina, D-001810-10), os seres humanos NO-TARGETplus SQSTM1 (SMARTpool, L-010230-00-0005), um humano NA-TARGETplus ATG7 (SMARTpool, L-020112-00), humanos NO TARGETplus ATG10 (SMARTpool, L-019426-01) foram ordenados a partir de Dharmacon e usado em uma concentração final de 50 a 100 nM.

GFP-trap ensaios

células HeLa foram transfected com EGFP-LC3 usando Mirus de Trânsito-2020 transfection reagent e 24 horas depois, foram lisadas em tampão de lise (50 mM de HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 5 mM EGTA) durante 10 minutos sobre gelo e granulado durante 10 minutos a 13 000 rpm. Proteínas marcadas com GFP (EGFP ou EGFP-LC3) foram puxadas para baixo usando grfp-TRAP beads (ChromoTek), de acordo com o protocolo do fabricante. Os imunoprecipitados foram eluídos fervendo as amostras em tampão de Laemmli durante 5 minutos. As proteínas foram resolvidas pela SDS-PAGE.

imunofluorescência

a imunocitoquímica foi realizada em células cultivadas com tampas de 22 × 22 mm. HeLa células foram cultivadas em um confluency 70-80%, lavadas uma vez com PBS e, em seguida, fixa, utilizando-4% (m/v) PFA por 5-7 minutos ou frio-metanol por 3 a 5 minutos, a 4 °C. note que, como a maioria dos anticorpos utilizados no estudo, trabalhou somente após a PFA fixação, as amostras foram geralmente fixado com 4% (m/v) PFA em PBS, a menos que de outra forma mencionados na legenda da figura(s). O PFA foi eliminado de acordo com os regulamentos de segurança e as células foram lavadas três vezes com PBS. As células foram então permeabilizadas usando 0.Triton X-100 a 5% v/v durante 5-7 minutos e lavado três vezes com PBS para remover qualquer detergente residual. Adicionou-se uma solução contendo 1% P/V de BSA às tampas, como solução de bloqueio, para reduzir a ligação não específica dos anticorpos primários e secundários, e manteve-se durante 1 hora à temperatura ambiente. A solução de bloqueio foi então retirada das tampas e os anticorpos primários em diluições apropriadas foram adicionados nas tampas. As tampas com anticorpos primários foram incubadas a 4 °C durante 16 a 20 horas numa câmara húmida e húmida. As tampas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas com uma solução contendo anticorpos secundários durante 1 hora à temperatura ambiente. (Note que as soluções primárias e secundárias de anticorpos foram feitas no tampão de bloqueio.) A diluição dos anticorpos secundários utilizados para este estudo foi de 1:400 preparados em solução de ASC a 1% p/v. Finalmente, as tampas foram lavadas duas vezes com PBS e água esterilizada de alta pureza e montadas em lâminas de vidro usando um meio de montagem pró-longo ouro anti-fade DAPI (Invitrogen, EUA). As tampas foram então fotografadas usando o microscópio confocal Zeiss LSM880 ou LSM780 usando o objetivo de imersão em óleo 63x.

imagens de células vivas

as células knockouts ATG16L1 foram semeadas nos pratos MatTek (MatTek, Ashland MA USA). No dia seguinte, estas células foram transfectadas com plasmídeo adequado com base em requisitos experimentais utilizando reagente de transfecção Trans-IT 2020 Mirus. A transfecção foi realizada utilizando o meio optiMEM, usando o protocolo do fabricante. Foi então utilizada uma solução-mãe Triton X-100 a 2% para atingir a concentração designada para a extracção detergente da membrana plasmática. Uma concentração final de Triton X-100 a 1% é capaz de extrair a ligação citosólica e membrana. A experiência para confirmar a presença de agregados p62 em células eliminatórias ATG16L1, no entanto, envolveu a extração de detergentes usando Tritão x-100 a 1,5% como a concentração final para submeter as células a condições mais duras de extração. Imaging then was performed using the ‘Time series’ module on an incubated Zeiss AxioObserver Z1 microscope with a LSM780 confocal microscope using a 63 × 1,4 na Plan Apochromat oil-immersion lens.

microscopia de Super resolução

amostras foram semeadas no Zeiss High precision no 1.5 170+ ou -5 µm, 18 mm × 18 mm coverslips. Após a coloração, as amostras foram montadas em ouro pró-Longo anti-fade DAPI meio de montagem (Life Technologies) e deixado para endurecer por 3 dias para chegar a um índice de refração constante (RI) de 1,46. As amostras foram fotografadas usando iluminação estruturada na ELYRA PS1 (Microscopia Carl Zeiss). Após o alinhamento dos estágios, linhas laser de 405, 488 e 561 nm foram usadas para visualizar uma pilha de contas, a fim de corrigir a aberração cromática usando o algoritmo de alinhamento dos canais. As pilhas Z foram adquiridas em 5 fases e 5 rotações da rede de iluminação e subsequentemente processadas e alinhadas usando o software ZEN Black Elyra edition (Microscopia Carl Zeiss).

extracção das fracções solúveis e insolúveis

a extracção das fracções solúveis e insolúveis das células eliminatórias ATG16L1 foi efectuada no tampão RIPA. Brevemente, as células foram lavadas com 1x de PBS gelados uma vez e foram raspadas, lisadas em 500 µl de tampão RIPA e recolhidas em tubos rotulados mantidos em gelo. A composição do tampão RIPA foi a seguinte:

tampão RIPA

50 mM Tris –HCl (pH 7.4)

150 mM NaCl

5 mM EDTA

1% Triton X-100

0.5% deoxicolato de sódio

0.1% SDS

no momento da utilização, o tampão RIPA foi complementado com comprimidos completos inibidores da protease (1 comprimido por 50 ml) e coquetéis inibidores da fosfatase 2 e 3 (1:100 cada).

os lisados passaram 10 vezes através de uma agulha de 25 G e, em seguida, a solução foi centrifugada a 14000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. após centrifugação, o sobrenadante foi recolhido num tubo Eppendorf fresco e foi rotulado como a fracção solúvel e misturado com 300 µl de tampão de 2x Laemmli e fervido durante 5 minutos. O sedimento obtido após centrifugação consiste na fracção insolúvel e foi ressuspendido e lavado com 500 µl de tampão RIPA. A solução ressuspendida foi então centrifugada a 14000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. o sobrenadante foi eliminado e o sedimento ressuspendido em 100 µl de tampão de ureia + RIPA. Este foi finalmente misturado com 100 µl de tampão de 2X Laemmli e foi fervido por 5 minutos. A composição do tampão ureia + RIPA consiste em ureia adicional a uma concentração final de 2 M, juntamente com os componentes do tampão RIPA.

Western blot

células cultivadas em placas de 6 poços foram lisadas e recolhidas em tampão de laemmli 2X (4% W/V SDS, 20% v/v glicerol, 10% v/v 2-mercaptoetanol, 0.004% w/v Azul de bromofenol e 125 mM Tris HCl, pH 6.8). Depois que as células foram lisadas, 20-30 µl das amostras foram carregadas em um 10-well, 12-15% SDS-PAGE e correr em 100-120 V. uma escada padrão M. W. foi carregada juntamente com as amostras para manter uma pista do movimento das proteínas no gel. As proteínas foram então transferidas para a PVDF ativada a 100 V durante 60 minutos. A membrana foi removida após a transferência e foi embebida em leite desnatado de 5% p/v para bloquear locais de ligação não específicos, durante 1 hora à temperatura ambiente. Ao lado, uma solução contendo o anticorpo primário específico (preparado em 5% (m/v) de leite desnatado) em uma diluição adequada foi adicionada para a membrana para incubação overnight a 4 °C. As membranas foram então lavadas três vezes com PBST (tampão Fosfato-salina +0,1% de Tween-20) antes da adição do anticorpo secundário. O anticorpo secundário, também preparado em 5% P/v de leite desnatado, foi incubado com a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente. A diluição do anticorpo secundário foi geralmente mantida a 1:4000 para o aumento da quimioluminescência (ECL) de anticorpos conjugados com HRP e a 1:5000 para os anticorpos conjugados com fluoróforo LICOR. As membranas foram então lavadas novamente com PBST várias vezes e desenvolvidas usando uma mistura de volumes iguais de soluções de Desenvolvimento 1 e 2 para ECL ou fotografadas diretamente para detecção de sinal de fluorescência usando software LICOR Image Studio (LICOR, EUA).

CRISPR knockout cell generation

the guide RNAs were designed for the generation of ATG9 knockout cells using the online tool developed by the Zhang Lab21. Os três primeiros resultados de ARN guia único (sgRNA) foram modificados manualmente para adicionar locais de restrição de BbsI e estas sequências de pureza dessaltada foram ordenadas a partir de Invitrogênio. A sequência usada com sucesso para o Knockout ATG9 CRISPR foi:

O destaque nucleotídeos indicar adicionado balanços. O sgRNA foi então ligado na espinha dorsal psCas9-2A-puromicina. Os plasmídeos ligados com sucesso ou o Controle Cas9 vazio do vetor foram então transfectados em células HeLa e a expressão foi permitida por 24 horas. As células transfectadas foram então seleccionadas adicionando puromicina às células a uma concentração final de 2-4 µg/ml. As células foram autorizadas a crescer até que todas as células não transfectadas estivessem mortas. As células positivas foram então tripsinizadas e o número de células foi avaliado utilizando diapositivos de Condessa de Invitrogénio (suspensão celular homogeneizada de 10 µl +azul de Trípano de 10 µl). Com base na população de células vivas, 0,2 × 104 células foram aspiradas e serialmente diluídas em uma placa de 96 poços para obter colônias de células únicas. A diluição em série foi sempre 1:1 e o volume final em cada alvéolo no final da diluição foi mantido a 200 µl. Os lisados celulares foram então carregados em SDS-PAGE, transferidos para uma membrana para verificar o knock-out de ATG9.

quantificação de dados e análise estatística

as imagens foram quantificadas usando o plugin padrão de ‘Análise de partículas’no ImageJ. Além disso, os pixels co-localizados foram identificados, e um perfil foi gerado usando um algoritmo de plugin ImageJ não supervisionado chamado ‘coloralização’, que foi desenvolvido por Pierre Bourdoncle (Institut Jacques Monod, Service Imagerie, Paris; 2003–2004). As blots ocidentais foram quantificadas usando o software LICOR Image Studio (LICOR, EUA) e os valores foram processados, analisados e plotados usando o programa Excel do pacote Microsoft Office.

os níveis de significância estatística para comparações entre dois grupos foram estimados utilizando testes T de cauda única ou de duas caudas. Para a experiência que envolveu ATG7 e ATG10 KD, foi utilizado um teste T de cauda única para avaliar a significância estatística dos dados. Para todas as outras experiências deste estudo, foi utilizado um teste T de duas caudas para avaliar a significância estatística dos dados. Neste artigo, o valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo e as convenções utilizadas para descrever os resultados deste artigo são as seguintes: *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001 e as barras de erro representam desvios padrão, salvo indicação em contrário.